第五章 基因藥物專題

生物制藥技術(shù)

蔡謹(jǐn)676417）Caij@浙江大學(xué)玉泉校區(qū)教十5212室

Chapter5GeneMedicine(genetherapy)1.概念基因：染色體上的DNA片段，是遺傳信息結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。基因決定生老病死控制高矮胖瘦影響喜怒哀樂(lè)基因組：某一生物的細(xì)胞中所帶有的全部遺傳信息。一.概述基因與疾病基因與人類的疾病密切相關(guān)：遺傳病是由于基因先天缺陷所致;腫瘤的發(fā)生涉及多種基因改變,包括癌基因激活或抑癌基因失活;高血壓,糖尿病等多基因病也涉及到多種基因的改變;由病原體所致的傳染病也和人體基因密切相關(guān),存在易感人群和耐受人群.

基因藥物：

將具有治療作用的基因重組進(jìn)真核表達(dá)載體，直接轉(zhuǎn)移到人體細(xì)胞，表達(dá)出具有治療作用的蛋白質(zhì)和多肽，從而達(dá)到治療作用的新方法。TheapplicationofgeneticprinciplesinthetreatmentofhumandiseaseByintroductionofgenetic

materialintotargetcellsinordertocounteracttheeffectofadiseasegeneorintroduceanewfunction

“Youmayneverhavetopurifyaprotein,ormanufactureadrug,youjusthavetomakethevectorandgetintothepatient.Whybothermarketingit?Youcanjustletthecelldoit.”

Prof.JumWilsome,美國(guó)基因治療中心主任基因治療的必要條件UnderstandingofthediseaseprocessStructure/functionofgenetobeintroducedEfficientdeliveryofgenecontrolofgeneexpressionPrevention/controlofimmuneresponsesAnimalmodelandassessmentoffunctionClinicaltrial研究基因治療的三個(gè)基本步驟

尋找適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞

導(dǎo)入目的基因

基因表達(dá)分類生殖細(xì)胞基因治療（germlinegenetherapy）生殖細(xì)胞或早期胚胎細(xì)胞體細(xì)胞基因治療(somatic-cellgenetherapy)體細(xì)胞

體細(xì)胞基因治療始終需要考慮的問(wèn)題

基因轉(zhuǎn)移的效率

治療的特異性

基因表達(dá)的持久性及其調(diào)節(jié)

治療的毒副作用

什么疾病

什么基因

什么載體

什么靶器官和靶細(xì)胞

什么基因?qū)敕椒ǘ⒒蛑委熀蛡鹘y(tǒng)的基因工程的區(qū)別

二者都著眼于尋找可治病或有其他應(yīng)用價(jià)值的“目的基因”。基因工程：目的基因——載體——導(dǎo)入大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞——體外表達(dá)所需要的蛋白——經(jīng)過(guò)分離純化獲得能用于治療或其他用途的蛋白純品,最終是制造出一種蛋白類的藥物。

基因治療——目的基因——載體——導(dǎo)入人體，目的基因在人體內(nèi)的細(xì)胞中制造所需要的蛋白——達(dá)到治病的目的?；蛑委熢诩夹g(shù)上一旦成功,其優(yōu)勢(shì)：①制品為基因及其載體，非基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物,不需復(fù)雜的蛋白產(chǎn)物分離和純化工藝②生產(chǎn)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于基因工程產(chǎn)品③從理論上講,凡能治病的基因，都有可能開(kāi)發(fā)成為“藥物”④半衰期多肽藥物基因藥物產(chǎn)物多肽－蛋白質(zhì)基因載體無(wú)信號(hào)肽有信號(hào)肽宿主細(xì)胞大腸桿菌酵母等人體細(xì)胞（體內(nèi)）轉(zhuǎn)染容易難生產(chǎn)工藝復(fù)雜較簡(jiǎn)單純化復(fù)雜較簡(jiǎn)單成本高較經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定性低高保存難易半衰期短長(zhǎng)用法長(zhǎng)期注射一次性注射副作用高低

但基因治療難度高，技術(shù)要求極為苛刻。例如，針對(duì)各種疾病，必須具有能夠達(dá)到治病目的的基因。在此基礎(chǔ)上，還必須具有能有效地將基因?qū)肴梭w的載體系統(tǒng)，這種系統(tǒng)要求高效，而且能定向地導(dǎo)入人體某種細(xì)胞?；?qū)肴梭w后，必須能夠控制它的表達(dá)。

因此，基因治療是生物高技術(shù)的高度集成，是遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子病毒學(xué)等多種學(xué)科知識(shí)和技術(shù)的高度綜合。

三、基因治療的主要策略

GenereplacementGeneaugmentationtherapy(GAT)Genecorrection(Chimeraplasty)TargetedkillingofspecificcellsTargetedinhibitionofgeneexpression(Geneablation)Genereplacement:

Deficientgenecorrectedbyreplacingthemutatedallelewithanintactallele;usedforthetreatmentofautosomaldominantdisorders.Thestrategiesareasfollows:a)kockoutmutationbysinglecrossing-over(insertionalinactivation)

b)genereplacementbydouble(reciprocal)crossing-over

c)targetgeneinhibitionindominantnegativegeneticdisorders;usuallymutatedproteinswhichinteractwithnormalcellularproteinstocreatealteredproperties;mutationalinactivationoftheonemutatedcopywillalleviatethismutantphenotype;themutationcanbecarriedoutbyinsertionalinactivation,orantisensetechnology.GeneAugmentationTherapy(GAT)

FordiseasescausedbylossofgenefunctionmorecopiesofnormalgeneraiselevelsofgeneproductrestorenormalphenotypeApplyto:monogenicrecessivediseasescysticfibrosis,haemophilia,musculardystrophyGeneCorrection-ChimeraplastytumourcelltkthymidinekinasegeneviralvectorganciclovirganciclovirphosphateTargetedKilling–GeneticPro-drugActivationTherapyTargetedinhibitionofgeneexpression

Ribozymes

-cancleave(orrepair)mRNATriplehelixoligonucleotides-blockgenetranscription

Antisense

oligos-blockmRNAtranslationAllgenetherapystrategiesdependongettingthegeneorgeneticmaterialintothetargetcells!!!

治療方式矯正性基因治療基因置換（genereplacement）基因矯正(genecorrection)基因增強(qiáng)(geneaugmentation)調(diào)控性基因治療調(diào)控基因的表達(dá)來(lái)達(dá)到改善疾病的目的（1）反義技術(shù)A）反義基因到載體，耙細(xì)胞到反義RNA，封閉mRNA的翻譯B)合成反義寡聚脫氧核苷酸，化學(xué)修飾導(dǎo)入體內(nèi)，胞吞與DNA結(jié)合形成核苷酸三聚體，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄不能啟動(dòng)；或與mRNA結(jié)合形成RNA-DNA雜鏈，影響基因的表達(dá)。C）核酶

具有催化作用的RNA分子，能催化切割降解異常表達(dá)基因的RNA分子，已經(jīng)設(shè)計(jì)出特殊的核酶。（2）通過(guò)其他基因的代償作用彌補(bǔ)缺陷基因的功能。四.基因轉(zhuǎn)移體系若干相關(guān)術(shù)語(yǔ)：

Transfection轉(zhuǎn)染：過(guò)去：將病毒DNA或RNA

轉(zhuǎn)入細(xì)胞。

現(xiàn)在：將外源DNA轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞。

DNATransfer轉(zhuǎn)移：基因?qū)牖蜣D(zhuǎn)移廣義的概念。

Transduction轉(zhuǎn)導(dǎo)：噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌之間的基因

轉(zhuǎn)移。

Transformation轉(zhuǎn)化：將裸DNA或質(zhì)粒導(dǎo)入原核

和真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)移途徑

1）exvivo法，體外途徑。體外基因?qū)肴梭w細(xì)胞，再將細(xì)胞植入人體。經(jīng)典，安全，效果較易控制，對(duì)基因轉(zhuǎn)移效率要求不高，但步驟多，復(fù)雜，難度大。

2)invivo法，體內(nèi)途徑。將含治療基因的重組載體直接植入體內(nèi)。操作簡(jiǎn)單，容易推廣，但對(duì)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)要求高。aaaaaaEx-vivoIn-vivotopicaldeliveryIn-vivosystemicdeliveryVExamples:-bonemarrow-livercells-skincellsExamples:-brain-muscle-eye-joints-tumorsExamples:-Intrav－enous-intra-arterial-intra-peritonealTHREEclassesofanatomicalgenedelivery基因治療過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)移方法

Viralvectors

Non-viralvectors

Physicalmethods

目前最有效的是病毒載體，但存在插入大小有限、免疫原性強(qiáng)和生產(chǎn)難等局限1、病毒載體類型反轉(zhuǎn)錄病毒（RV）載體retrovirus腺病毒（AV）載體adenovirus

腺相關(guān)病毒（AAV）載體Adeno-associatedvirus單純皰疹病毒（HSV）載體herpessimplexvirus

慢病毒（lentivirus)載體等對(duì)載體的基本要求：特異并有效的基因轉(zhuǎn)移特異、高效、持續(xù)性表達(dá)，具有可控性免疫原性低易于生產(chǎn)載體特征：

reproducibility stablepropagated purifiedtohightiters mediatedtargeteddelivery基因治療病毒載體比較

RVAVAAVHSVLV基因組成ssRNAdsDNAssDNAdsDNAdsRNA基因組長(zhǎng)度10kb36kb5kb152kb10kb裝載容量<8kb8kb4.5kb30kb9kb病毒滴度107

1011

108

108108感染細(xì)胞譜窄寬寬窄寬感染能力中很強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)中整合能力有無(wú)有無(wú)強(qiáng)毒性作用遺傳毒細(xì)胞毒遺傳毒細(xì)胞毒遺傳毒免疫原性弱中等弱強(qiáng)弱病毒型載體逆轉(zhuǎn)錄病毒腺病毒皰疹病毒腺相關(guān)病毒慢病毒優(yōu)點(diǎn):●安全，對(duì)人體低病原性●針對(duì)增殖的細(xì)胞●長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)●外源基因插入能力適中。缺點(diǎn):●導(dǎo)入率低●隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞，有插入性基因突變或癌變的危險(xiǎn)●無(wú)導(dǎo)向性。優(yōu)點(diǎn):●高效導(dǎo)入、高滴度●非增殖細(xì)胞也能導(dǎo)入，對(duì)遺傳、代謝病有利●基因插入能力強(qiáng)（<30kb）●宿主廣泛缺點(diǎn):●有嚴(yán)重的免疫反應(yīng)?！駸o(wú)導(dǎo)向性優(yōu)點(diǎn):●無(wú)細(xì)胞毒性，無(wú)免疫反應(yīng)●轉(zhuǎn)導(dǎo)穩(wěn)定，長(zhǎng)期表達(dá)●具有在特定位點(diǎn)整合的潛力，導(dǎo)入基因后可特殊表達(dá)●個(gè)體小，可廣泛分布。缺點(diǎn):●可做到高滴度,但包裝困難●有隨機(jī)整合的可能●基因插入量有限（<5kb）優(yōu)點(diǎn):●有嗜神經(jīng)性，可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病●有環(huán)狀分子形式的潛伏狀態(tài)●基因插入容量大。缺點(diǎn):●細(xì)胞毒性和免疫原性不定●潛伏期HSV-1可能回復(fù)突變?yōu)橐吧?導(dǎo)致腦炎或死亡優(yōu)點(diǎn):●能轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞●中等插入量。缺點(diǎn):●隨機(jī)整合●可能回復(fù)突變?yōu)橐吧汀etrovirusadenovirusHSVAAVlentivirus反轉(zhuǎn)錄病毒載體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)輔助細(xì)胞:

將含有病毒結(jié)構(gòu)基因但缺失了順式包裝信號(hào)的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞（ψ—2，PA317，ψCRIP）。可產(chǎn)生病毒包裝蛋白但不產(chǎn)生病毒顆粒；反轉(zhuǎn)錄病毒載體:以外源目的基因替換病毒結(jié)構(gòu)基因,含病毒包裝信號(hào)輔助細(xì)胞提供載體包裝蛋白，使后者產(chǎn)生含外源目的基因的病毒顆粒

缺陷型的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的RNA進(jìn)入靶細(xì)胞后，變成前病毒并整合到宿主細(xì)胞的染色體上，可穩(wěn)定表達(dá)外源基因。反轉(zhuǎn)錄病毒只能感染處于增殖期的細(xì)胞。

反轉(zhuǎn)錄病毒安全性問(wèn)題病毒感染的可能性病毒在靶細(xì)胞基因組整合可導(dǎo)致:

破壞細(xì)胞正常生長(zhǎng)必需的抑癌基因

LTR激活原癌基因染色體重排激活原癌基因腺相關(guān)病毒（AAV）載體：4.7kb單鏈DNA，結(jié)構(gòu)為ITR-rep-cap-ITR，病毒基因組簡(jiǎn)單，易于消除，可降低細(xì)胞毒性和T-淋巴細(xì)胞反應(yīng)的危險(xiǎn)性；病毒DNA可在人19號(hào)染色體上進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合，需要輔助因子出現(xiàn)才復(fù)制；其Rep蛋白可能介導(dǎo)這種定向整合宿主范圍寬，易感染造血干細(xì)胞，能潛伏感染非分裂期細(xì)胞；在動(dòng)物模型中表達(dá)可持續(xù)半年以上。但AAV載體接納的外源DNA小于4.5kb，載體整合效率較低，制備困難HSV病毒雙鏈DNA,包括:HSV-1,2,VZV,EB,CMV.

主要以HSV-1型為主.HSV載體含包裝信號(hào),復(fù)制位點(diǎn)等順序結(jié)構(gòu),HSV病毒啟動(dòng)子,目的基因表達(dá)框架.由輔助病毒共轉(zhuǎn)染輔助細(xì)胞M64A,制備重組病毒.

輔助病毒的改造:IE3溫度敏感突變型;

缺失突變型:IE3缺失;

應(yīng)用:感染心肌細(xì)胞,神經(jīng)元,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞.VEGF---血管形成;腦腫瘤;帕金森病

Lentivirus（慢病毒載體）優(yōu)點(diǎn):感染非分裂細(xì)胞，有RV優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu):LTR-gag-pol--env--LTR

TARtat,rev,tev應(yīng)用:宿主廣泛;艾滋病基因治療問(wèn)題:安全性2、非病毒及物理方法脂質(zhì)體介導(dǎo)法磷酸鈣轉(zhuǎn)染法機(jī)械法（顯微注射、基因槍等）DEAE-葡聚糖和polybrene(聚凝胺)轉(zhuǎn)染法電穿孔法超聲波輔助法納米材料等中性脂質(zhì)體

由脂類形成的可高效包裝DNA的人造單層膜，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與細(xì)胞膜極為相似，二者易于融合，細(xì)胞的內(nèi)吞作用使其進(jìn)入細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)50%，可用于體內(nèi)試驗(yàn)，但目的基因表達(dá)不穩(wěn)定陽(yáng)離子脂質(zhì)體：陽(yáng)離子脂質(zhì)體在水中可形成大小約100-400nm單層脂質(zhì)體。其帶正電，帶負(fù)電的DNA可自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，與細(xì)胞膜作用使DNA進(jìn)入細(xì)胞。在該系統(tǒng)體內(nèi)基因?qū)胄实?，且無(wú)靶向性。在體內(nèi)應(yīng)用，除腫瘤瘤內(nèi)注射外，其前景仍存在問(wèn)題。磷酸鈣轉(zhuǎn)染法：將氯化鈣、目的DNA和磷酸緩沖液混合，沉淀形成含有DNA的極小的不溶性磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜，通過(guò)胞飲進(jìn)入受體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)染過(guò)程簡(jiǎn)單有效，適用于貼壁、非貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)20%左右，但目的基因表達(dá)不穩(wěn)定機(jī)械法

如顯微注射和基因槍（biolisticparticle）。顯微注射使用一根細(xì)針頭將外源DNA直接轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核?；驑屖褂酶邏篋NA分子導(dǎo)入細(xì)胞。

基因槍工作原理顯微注射電穿孔法通過(guò)將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)目的DNA。細(xì)胞懸浮液置于電場(chǎng)中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。一般，成功的電穿孔過(guò)程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。DEAE-葡聚糖和polybrene轉(zhuǎn)染法

帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的外源DNA分子作用，使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過(guò)使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將外源DNA導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

裸DNA基因轉(zhuǎn)移和治療進(jìn)展 展望裸DNA肌肉注射，活體轉(zhuǎn)移 非病毒基因轉(zhuǎn)移越來(lái)越重要電擊促進(jìn)質(zhì)粒DNA進(jìn)入肌肉皮膚 未來(lái)幾年遺傳病臨床試驗(yàn)將首選血友病血管內(nèi)導(dǎo)入質(zhì)粒DNA，肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移 Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良，關(guān)節(jié)炎等尾靜脈導(dǎo)入pDNA，簡(jiǎn)單有效，轉(zhuǎn)染大、嚙齒類的尾靜脈注射作為快速檢測(cè)表小鼠肝細(xì)胞達(dá)狀況和基因治療方法廣泛應(yīng)用pDNA表達(dá)載體可高水平持續(xù)表達(dá) 血管內(nèi)裸DNA導(dǎo)入為細(xì)胞有效涉入pDNA RNAi將在基因治療領(lǐng)域中成為重要手裸DNA導(dǎo)入法已經(jīng)在臨床研究（PAOD，段外周動(dòng)脈閉鎖癥）SiRNA可通過(guò)血管內(nèi)基因轉(zhuǎn)移法有效導(dǎo)入Knockout小鼠基因治療載體的發(fā)展趨勢(shì)綜合病毒載體與非病毒載體的優(yōu)勢(shì),構(gòu)建雜種病毒載體其需要達(dá)到的境界：靶向性進(jìn)入特異細(xì)胞表達(dá)持久、可控、安全、高效商業(yè)化定做（tailor

made)依據(jù)特異的治療 依據(jù)不同個(gè)體五.細(xì)胞的選擇體外基因治療靶細(xì)胞的基本要求：1.應(yīng)來(lái)自受治者。2.可以或容易從體內(nèi)獲得。3.容易在體外培養(yǎng)和大量擴(kuò)增。4.易被重組基因轉(zhuǎn)染。5.輸回體內(nèi)能確保攜帶的目的基因穩(wěn)定表達(dá)。6.能在體內(nèi)存活一段時(shí)間。7.不影響臨近組織的正常生理功能?；蛑委煶Ｓ眉?xì)胞★1.骨髓細(xì)胞

?造血干細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：●源自造血干細(xì)胞的細(xì)胞遍布全身，幾乎存在于所有器官組織，可治療一些與其不直接相關(guān)的疾病?！裼行┻z傳病直接與其有關(guān)。缺點(diǎn)：●改造的細(xì)胞很少?！裰委熁蛟诩?xì)胞中表達(dá)的時(shí)間太短?！窀杉?xì)胞分化導(dǎo)致基因失活?！裼行┻z傳病與造血干細(xì)胞完全無(wú)關(guān)

特點(diǎn)：

●可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪或肌肉細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，也可分化為造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞?！窨衫枚ㄏ蚍只纳L(zhǎng)因子轉(zhuǎn)入干