第六章 目的基因的分離2014

基因工程的基本步驟

目的基因的獲取基因載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的拼接重組子導(dǎo)入受體分子外源基因的表達和產(chǎn)物的分離第六章目的基因的分離基因工程的上游工程是目的基因的制取和無性繁殖。具體地說是從生物體的組織、器官或細胞制取目的基因，或人工合成目的基因，使目的基因與載體連接，導(dǎo)入受體細胞，篩選和進行無性繁殖。這個過程稱為基因克?。╣enecloning）。克隆的概念:個體水平上:表示由具有相同基因型的同一物種的兩個體或數(shù)個個體組成的群體,如雙胞胎.細胞水平上:由同一個祖細胞分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體.分子水平上:凡帶有一段DNA插入序列的,獨特的寄主/載體單元亦叫克隆.比如重組質(zhì)粒載體克隆基因的方法PCR或人工合成法從基因組文庫或cDNA文庫中分離基因差減雜交法、扣除雜交、差異顯示法

基因文庫：指某個生物的基因組DNA或cDNA片段與適當?shù)妮d體在體外通過重組后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合按照外源DNA片段的來源，可將基因文庫分為：基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary）和cDNA文庫（complementaryDNAlibrary）。從基因文庫中克隆目的基因一、cDNA文庫的構(gòu)建與篩選(一)概念：將生物特定的組織器官或特定發(fā)育時期的全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA群體，并插入到適當?shù)妮d體分子上，然后轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細胞，這個細胞群體內(nèi)包含了所有基因編碼序列的cDNA分子，被稱為cDNA文庫。cDNA文庫特點只包括在特定的組織或細胞類型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA的那些基因序列。由于不同的細胞類型、發(fā)育階段以及細胞所處的特定的狀態(tài)是由特定基因的表達所決定，因此各自的mRNA的種類不同，由此產(chǎn)生出獨特的cDNA文庫。任何一個cDNA文庫都不可能包含某一生物全部編碼基因。

cDNA文庫的優(yōu)越性以mRNA為材料,特別適用于某些RNA病毒篩選比較簡單易行.假陽性概率低cDNA克隆可進行原核表達構(gòu)建cDNA文庫應(yīng)滿足的條件文庫的代表性:文庫中包含的重組cDNA分子反映來源細胞中表達信息的完整性.N=Ln(1-P)/Ln(1-n/T)P:文庫中篩選出某一確定克隆的置信度,一般情況下選擇0.99.N:文庫中以P概率出現(xiàn)細胞中任何一種mRNA序列理論上應(yīng)具有的最少重組子克隆數(shù);n:細胞中最低豐度的mRNA的拷貝數(shù);T:細胞中表達出的所有mRNA的總拷貝數(shù)重組cDNA片段的序列完整性(二)、構(gòu)建cDNA文庫的方法（1）分離細胞總RNA，從中分離出mRNA。（2）以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈。（3）將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子。（4）將合成的雙鏈cDNA重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，導(dǎo)入大腸桿菌寄主細胞內(nèi)增殖。通常用λgt10/λgt11及與其相當?shù)妮d體來組建非表達的cDNA文庫，而一般不用轉(zhuǎn)化效率較低的質(zhì)粒作載體。cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略

cDNA第一鏈的合成

5‘pppG

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’dNTPs逆轉(zhuǎn)錄酶5‘pppG

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一鏈cDNA第二鏈的合成

自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失5‘pppG

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’NaOH煮沸TTTTTTTTTTTTTTp

5’OH

3’KlenowdNTPsTTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’S1AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTcDNA第二鏈的合成

置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’RNaesHDNApoldNTPsAAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’S1T4-DNAligaseAAAAAAAAAAAAAA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’cDNA第二鏈的合成引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列ppp5’G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’TdTdCTPppp5’G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’NaOH退火5‘

pGGGGGGG5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’KlenowdNTPsTTTTTp

5’雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中:平頭末端直接與載體連接,但插入的片段無法回收

平頭兩端分別接同聚物尾，重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收

以質(zhì)粒為載體構(gòu)建cDNA文庫以l噬菌體作載體構(gòu)建cDNA文庫的流程圖(三)目的cDNA克隆的篩選核酸雜交免疫學(xué)雜交檢測:通過重組克隆所表達的基因產(chǎn)物篩選目的克隆

如果雙鏈cDNA重組到表達載體上，則cDNA就能隨著表達載體而表達出融合蛋白質(zhì)，這樣的文庫稱為cDNA表達文庫PCRcDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)細菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因二、基因組文庫的構(gòu)建與基因分離基因庫（genepool）:特定生物體全基因組的集合（天然存在）

基因組文庫（genelibraryorgenebank）

將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細胞中保存和擴增.理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因組文庫。2.構(gòu)建基因文庫的載體選用載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少目前常用的載體

載體系列：容量為23kbcosmid載體：容量為45kb

YAC：容量為450-1MbBAC:容量為300kb3構(gòu)建基因組文庫應(yīng)滿足的條件（1）文庫的完整性:在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：

N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率;f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小

例如，人的單倍體DNA總長為2.9x109bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克隆；而當完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克?。?）基因組信息的可重建性4.基因組文庫構(gòu)建的一般步驟基因組DNA的分離制備DNA大片段的制備:

超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法載體DNA的制備：常用λ噬菌體DNA或粘粒作為載體;雙臂的制備，除去非必要區(qū)段。載體與基因組DNA大片段的連接體外包裝及基因組文庫的擴增重組DNA的篩選和鑒定鳥槍法：用生物化學(xué)方法，如用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進行切割，得到很多在長度上同一般基因大小相當?shù)腄NA片段，然后將這些片段混合物隨機重組入適當?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后在受體菌中進行擴增，再用適當?shù)姆椒êY選出目的基因。用Sau3A限制酶消化真核基因組DNA在l噬菌體載體上構(gòu)建基因組文庫

在酵母人工染色體上克隆DNA基因文庫的保存和利用噬菌體及其衍生載體構(gòu)建的DNA文庫的保存:分裝,2%-3%氯仿4度保存數(shù)月.填加7%的二甲基亞砜,80度保存數(shù)年.大片段的基因文庫:含抗凍液和抗生素的96孔或384孔無菌培養(yǎng)板保存7.5%的甘油可作為抗凍液.三、PCR擴增獲得目的基因使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物1引物設(shè)計:決定擴增效果的關(guān)鍵

可在5’端添加限制性內(nèi)切酶識別序列及保護堿基.引物效果檢驗和PCR參數(shù)確定

退火溫度影響最大常規(guī)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物一般在3kb以下,主要是因為隨著擴增片段延長,擴增效率降低.3設(shè)計簡并引物和擴增核心區(qū)段由TaqDNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為TaqDNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆

常規(guī)PCR衍生的幾種基因克隆技術(shù)反向PCR錨定PCR逆轉(zhuǎn)錄PCRcDNA末端的快速擴增(RACE)(一)熱不對稱交錯PCR(tail-PCR)也是獲得已知DNA序列側(cè)翼未知序列的一種PCR方法設(shè)計3個嵌套的特異性引