第七節(jié)-維生素的測(cè)定

第七節(jié)維生素的測(cè)定第一食品中的維生素及測(cè)定意義

第二脂溶性維生素的測(cè)定

第三水溶性維生素的測(cè)定重點(diǎn)掌握脂溶性維生素的測(cè)定（維生素A的測(cè)定），水溶性維生素的測(cè)定（維生素C的測(cè)定）的操作知識(shí)。了解維生素的概念，各類維生素的性質(zhì)及生理功能和相關(guān)知識(shí)第一食品中的維生素及測(cè)定意義一、概念：維生素：指維持人體正常生命活動(dòng)所必需的一類天然的有機(jī)化合物。其種類很多，被認(rèn)為對(duì)維持人體健康和促進(jìn)發(fā)育至關(guān)重要的有20余種。這些維生素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化性質(zhì)及生理功能各異，有的屬于醇類，有的屬于胺類，有的屬于酯類，還有的屬于酚或醌類化臺(tái)物。二、維生素的特性：1、維生素或其前體化合物都在天然食物中存在；2、不能供給機(jī)體熱能，也不是構(gòu)成組織的基本原料；3、主要功用是通過作為輔酶的成份調(diào)節(jié)代謝過程，需要量極小；4、一般在體內(nèi)不能合成，或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝取；5、長(zhǎng)期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。三、維生素的種類：1.根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)：胺類、醛類、醇類、酚式、醌類等。2.根據(jù)其物理性質(zhì)（溶解性）可分為：(1)脂溶性維生素：維生素A、維生素D、維生素K、維生素E。(2)水溶性維生素：維生素C、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素P、維生素PP。四、測(cè)定維生素的意義有助于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，開發(fā)利用富含維生素的食品資源2.指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，防止維生素缺乏癥3.研究維生素在食品加工、貯藏等過程中的穩(wěn)定性，指導(dǎo)人們制定合理的工藝條件及貯存條件，最大限度地保留各種維生素4.監(jiān)督維生素強(qiáng)化食品的強(qiáng)化劑量五、維生素的分析方法

它們由植物合成并且通常以微量存與植物體中。如果植物組織中的蛋白質(zhì)，脂肪和碳水化合物的含量是百分之幾，那么維生素的量只能以百分之零點(diǎn)幾甚至更小來計(jì)算。這就要求對(duì)植物中維生素的測(cè)定方法既要具有特別高的靈敏度又要有足夠的精確度。

維生素分析的方法有化學(xué)法、儀器法、微生物法和生物鑒定法。測(cè)定方法比較:

第二脂溶性維生素的測(cè)定

一、脂溶性維生素的理化性質(zhì)：1．溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑。2．耐酸堿性：VA、VD對(duì)酸不穩(wěn)定，VE對(duì)酸穩(wěn)定。VA、VD對(duì)堿穩(wěn)定，VE對(duì)堿不穩(wěn)定。3．耐熱性、耐氧化性：VA、VD、VE耐熱性好，VA易被氧化，光、熱促進(jìn)其氧化；VD不易被氧化；VE在空氣中能慢慢被氧化，光、熱、堿能促進(jìn)其氧化作用。結(jié)論：在測(cè)定維生素時(shí)，要根據(jù)其性質(zhì)控制好測(cè)定條件。

二、脂溶性維生素的測(cè)定步驟（一）用皂化法處理樣品，水洗去除類脂物。（二）用有機(jī)溶劑提取脂溶性維生素。（三）濃縮后溶于適當(dāng)?shù)娜軇┖鬁y(cè)定。三維生素A的測(cè)定

維生素A存在于動(dòng)物性脂肪中，主要來源于肝臟、魚干油、蛋類、乳類等動(dòng)物性食品中。植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡蘿卜素，它在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)閂A，故稱為VA原。維生素A：由β－紫羅酮環(huán)與不飽和一元醇所組成的一類化合物及其衍生物的總稱。包括A1和A2。維生素A1：視黃醇，有多種異構(gòu)體，可轉(zhuǎn)化成多種衍生物。類視黃素：維生素A2（3-脫氫視黃醇）、視黃醛、視黃酸、3-脫氫視黃醛、3-脫氫視黃酸是維生素A1的衍生物，具有維生素A同樣的作用，總稱為類視黃素。（一）紫外分光光度法1．原理維生素A的異丙醇溶液在325nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰，其吸光度與維生素A的含量成正比。2．適用范圍及特點(diǎn)靈敏度較比色法高，可測(cè)定維生素A含量低于5ug／g的樣品。但在維生素A最大吸收波長(zhǎng)325nm附近許多其他化合物也有吸收。本法適用于透明色油，維生素A的濃縮物等純度較高的樣品。3．試劑①維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液視黃醇85%（或視黃醇乙酸脂90%）經(jīng)皂化處理后使用。稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用脫醛乙醇溶解使其濃度大約為1mg/mL。臨用前需進(jìn)行標(biāo)定。取標(biāo)定后的維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成10I.U/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

標(biāo)定：取VA溶液若干微升，用脫醛乙醇稀釋3.00mL，在325nm處測(cè)定吸光度，用此吸光度計(jì)算出VA的濃度。

A13.00C=—×———×——————E100S×10C——VA的濃度g/mLA——VA的平均吸光度值

S——加入的VA溶液量uLE——1%VA的比吸光系數(shù)：1835②無水脫醛乙醇：取2g硝酸銀溶入少量水中。取4g氫氧化鈉溶于溫乙醇中。將兩者傾入盛有1L乙醇的試劑瓶中，振搖后，暗處放置兩天（不時(shí)搖動(dòng)促進(jìn)反應(yīng)）。取上層清液蒸餾，棄去初餾液50mL.③酚酞：用95%乙醇配制成1%的溶液。④1:1氫氧化鉀，0.5mol/L氫氧化鉀。⑤無水乙醚（不含過氧化物）⑥異丙醇4.儀器：紫外分光光度計(jì)5.測(cè)定方法①標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：制備標(biāo)準(zhǔn)系列使用液→以空白液調(diào)儀器零點(diǎn)→在325nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度→繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分別取維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液(每毫升含10I．U)0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，于10毫升棕色容量瓶中，用異丙醇定容。②樣品處理皂化：稱取0.5-5g充分混勻的樣品于三角瓶中，加入10mL1:1氫氧化鉀及20-40mL乙醇，在電熱板上回流30min。加入10mL水，稍稍振搖，若有混濁現(xiàn)象，表示皂化完全。提?。簩⒃砘阂迫敕忠郝┒?，先用30mL水分兩次洗滌皂化瓶（若有渣，可用經(jīng)過脫脂棉過濾），再用50mL乙醚分兩次洗滌皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振搖兩分鐘（注意放氣），靜止分層后，水層放入第二分液漏斗。皂化瓶再用30mL乙醚分兩次洗滌，洗液倒入第二分液漏斗，振搖后靜止分層，將水層放入第三分液漏斗，醚層并入第一分液漏斗。重復(fù)操作3次。洗滌：向第一分液漏斗的醚液中加入30mL水，輕輕振搖，靜止分層后放出水層。再加15-20mL0.5mol/L的氫氧化鉀溶液，輕輕振搖，靜止分層后放出堿液。再用水同樣操作至洗液不使酚酞變紅為止。醚液靜止10-20min后，小心放掉析出的水。濃縮：將醚液經(jīng)過無水硫酸鈉濾入三角瓶中，再用約25mL乙醚洗滌分液漏斗和硫酸鈉兩次，洗液并入三角瓶中。用水浴蒸餾回收乙醚，待瓶中剩余約5mL乙醚時(shí)取下減壓抽干，立即用異丙醇溶解并移入50mL容量瓶中用異丙醇定容③樣品測(cè)定：取濃縮后的定容液于紫外分光光度計(jì)上在325nm處測(cè)定吸光度，通過此吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出VA的含量。6.結(jié)果計(jì)算c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得維生素A含量，I.U／mLm——樣品重量，g。V——樣品提取后加入異丙醇定容之體積，mL

（二）高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography)

HPLC法測(cè)定VA和VE含量1原理試樣中的VA及VE經(jīng)皂化處理后，將其從不可皂化部分提取至有機(jī)溶劑中。用HPLC反相柱（RP-C18），將VA和VE分離，經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)，并用內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定。2步驟1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線①維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制③HPLC分析色譜條件的選擇：ODS柱，流動(dòng)相（甲醇+水=98+2），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)300nm，進(jìn)樣量20μL，1.7ml/min。2步驟

2）樣品處理皂化：稱取1-10g樣品于皂化瓶中，加入30mL無水乙醇，攪拌均勻。加入5ml10%抗壞血酸、苯并[e]芘標(biāo)準(zhǔn)液2ml，混勻，加10ml氫氧化鉀溶液（1+1），混勻。于沸水浴中回流30min，使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷卻。提?。簩⒃砘阂迫敕忠郝┒?，先用50mL水分兩次洗滌皂化瓶（若有渣，可用經(jīng)過脫脂棉過濾），再用100mL乙醚分兩次洗滌皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振搖2min（注意放氣），靜止分層，棄去水層。洗滌：用約50ml水洗分液漏斗中的乙醚層，用pH試紙檢驗(yàn)直至水層不顯堿性（最初水洗輕搖，逐次振搖強(qiáng)度增加）。濃縮：將醚液經(jīng)過無水硫酸鈉濾入與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的250~300ml球形蒸發(fā)瓶中，用約100mL乙醚洗滌分液漏斗和無水硫酸鈉3次，洗液并入蒸發(fā)瓶中。旋蒸回收乙醚，待瓶中剩余約2mL乙醚時(shí)取下，氮?dú)獯蹈?，立即加?ml乙醇，混勻，溶解。將乙醇液移入一小離心管中離心5min。上清液供色譜分析。3計(jì)算

X=(c/m)×V×(100/1000)X—維生素含量，mg/ml；c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線查到的某種維生素的含量，μg/ml；m—試樣質(zhì)量，g；V—試樣濃縮定容體積，ml。

（三）三氯化銻比色法l．原理在氯仿溶液中，維生素A與三氯化銻可相互作用，生成藍(lán)色可溶性配合物，其顏色深淺與溶液中所含維生素A的含量成正比。該物質(zhì)在620nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其吸光度與維生素A的含量在一定的范圍內(nèi)成正比，故可比色測(cè)定。

2．適用范圍適用于維生素D含量較高的各種樣品(高于5—10ug／g)。3．儀器分光光度計(jì)4．試劑①無水硫酸鈉：不吸附維生素②乙酸酐③無水乙醚：不含過氧化物④無水乙醇：不含醛類物質(zhì)⑤三氯甲烷：不含分解物⑥25％三氯化銻—三氯甲烷溶液⑦1:1氫氧化鉀溶液：50gKOH溶于50mL水中。⑧0.5moL/L氫氧化鉀溶液⑨維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液5．測(cè)定方法樣品處理：除去脂肪，使維生素A從脂肪中分離出來①皂化：通過皂化得到一部分皂化物和一部分不皂化物從而把維生素和脂肪分開。皂化條件：C2H3OH︰脂類=8︰1；KOH量=脂量×皂化價(jià)（mg）×2.5；

皂化溫度與時(shí)間：70℃、30分鐘（至皂化瓶中加水不渾濁）稱取0.5-5g→搗碎或混勻→加入l0mL1：1氫氧化鉀及20-40ml乙醇→加熱回流30分鐘→皂化完全加入10m1水，稍稍振搖，若無混濁現(xiàn)象，表示皂化完全。②提?。核崛≡砘?、乙醚萃取不皂化物皂化液移入分液漏斗→用30ml水分兩次沖洗皂化瓶→用50m1乙醚分兩次沖洗皂化瓶→洗液并入分液漏斗→水層放入第二分液漏斗→再用30m1乙醚分兩次沖洗皂化瓶→洗液傾入第二分液漏斗→水層放入第三分液漏斗→醚層并入第一分液漏斗→如此重復(fù)操作，直到醚層不再使三氯化銻-三氯甲烷溶液呈蘭色為止。③洗滌：水提取皂化物、堿液提取醚溶性酸皂

在第一分液漏斗中→加入30ml水→分層后棄去水層→加入15—20ml0.5moL／L的氫氧化鉀溶液→棄去下層堿液→用水洗滌，至水洗液不再使酚酞變紅為止→醚液靜置l0—20分鐘后，小心放掉析出的水。④濃縮：水浴蒸餾，回收乙醚，濃縮至瓶中剩約5m1乙醚。將醚液經(jīng)過無水硫酸鈉濾入三角瓶中→用約25m1乙醚沖洗分液漏斗和硫酸鈉兩次，洗液并入三角瓶?jī)?nèi)→水浴蒸餾，回收乙醚→減壓抽干，立即準(zhǔn)確加入一定量三氯甲烷(約5m1左右)，使溶液中維生素A含量在適宜濃度范圍內(nèi)(3—5ug／m1)。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以維生素A含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線。取6個(gè)3cm比色杯順次移入標(biāo)準(zhǔn)系列使用液各1m1，每個(gè)杯中加乙酸酐l滴，在620nm波長(zhǎng)處，以l0mL三氯甲烷加1滴乙酸酐。制備標(biāo)準(zhǔn)系列使用液→制成標(biāo)準(zhǔn)比色系列→調(diào)節(jié)光度法零點(diǎn)→將標(biāo)準(zhǔn)比色系列按順序移到光路前，迅速加入9mL三氯化銻一三氯甲烷溶液，于6s內(nèi)測(cè)定吸光度(每支比色杯都在臨測(cè)前加入顯色劑)。準(zhǔn)確吸取維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于6個(gè)10mL容量瓶中，用三氯甲烷定容(3)樣品測(cè)定測(cè)定樣品空白液和樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的維生素A含量。取二個(gè)3cm比色杯，分別加入1mL三氯甲烷(樣品空白液)和1mL樣品溶液，各加1滴乙酸酐。其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。分別測(cè)定樣品空白液和樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的維生素A含量。6．結(jié)果計(jì)算

C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品溶液中維生素A的含量，ug/mLC0——由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品空白液中維生素A的含量，ug/mLm——樣品質(zhì)量，gV——樣品提取后加入三氯甲烷定容之體積，mL100/1000——將樣品中維生素A是由ug／g折算成mg／100g的折算系數(shù)如按國(guó)際單位，每1國(guó)際單位＝0.3ug維生素A。7說明及討論

①維生素A極易被光破壞，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在微弱光線下進(jìn)行，或使用棕色玻璃儀器。并且在6min中內(nèi)完成標(biāo)準(zhǔn)樣品及待測(cè)樣品的測(cè)定。②乙醚為溶劑的萃取體系，易發(fā)生乳化現(xiàn)象。在提取、洗滌操作中，不要用力過猛，若發(fā)生乳化，可加幾滴乙醇破乳。③所用氯仿中不應(yīng)含有水分，因三氯化銻遇水會(huì)出現(xiàn)沉淀，干擾比色測(cè)定。故在每毫升氯仿中應(yīng)加入乙酸酐1滴，以保證脫水。另外，由于三氯化銻遇水生成白色沉淀，因此用過的儀器要用稀鹽酸浸泡后再清洗。④由于三氯化銻與維生素A所產(chǎn)生的藍(lán)色物質(zhì)很不穩(wěn)定，通常生成6S后便開始比色，因此要求反應(yīng)在比色管中進(jìn)行，產(chǎn)生藍(lán)色后立即讀取吸光度。⑤如果樣品中含β-胡蘿卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干擾測(cè)定，可將濃縮蒸干的樣品用正己烷溶解，以氧化鋁為吸附劑，丙酮、乙烷混合液為洗脫劑進(jìn)行柱層析。⑥比色法除用三氯化銻做顯色劑外，還可用三氟乙酸、三氯乙酸做顯色劑。其中三氟乙酸沒有遇水發(fā)生沉淀而使溶液混濁的缺點(diǎn)。四VD的測(cè)定—三氯化銻比色法（AOAC法）

1原理

在三氯甲烷溶液中，VD與三氯化銻結(jié)合生成一種橙黃色化合物，呈色強(qiáng)度與VD的含量成正比。與三氯化銻可生成橙黃色化合物，在500nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。2操作步驟

（1）樣品處理①分離柱的制備。②純化。（2）測(cè)定①標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。②樣品測(cè)定。無水硫酸鈉硅藻土中性氧化鋁無水硫酸鈉3計(jì)算

ρ×V

X=

—————×100

m×1000X——樣品中VD的含量，mg／100g；

ρ——標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品溶液中VD的含量μg/mL；(如按國(guó)際單位，每國(guó)際單位＝0.025μg維生素D)；

V——樣品提取后用三氯甲烷定容之體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。4說明及注意事項(xiàng)1）食品中VD的含量一般很低，而VA、VE、膽固醇、甾醇等成分的含量往往都大大超過VD、嚴(yán)重干擾VD的測(cè)定，因此測(cè)定前必須經(jīng)柱層析除去這些干擾成分。2）操作時(shí)加入乙酰氯可以消除溫度的影響，可使靈敏度比僅用三氯化銻提高約3倍，并可減少部分甾醇的干憂。3）此法不能區(qū)分維生素D2和維生素D3，測(cè)定值是兩者的總量。第三水溶性維生索的測(cè)定一、水溶性維生素的性質(zhì)易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機(jī)溶劑；在酸性介質(zhì)中很穩(wěn)定；在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解；易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響，維生素B2對(duì)光，特別是紫外線敏感，易被光線破壞；維生素C對(duì)氧、銅離子敏感，易被氧化。二、測(cè)定水溶性維生素時(shí)的前處理方法（一）維生素Bl、B2通常采用鹽酸水解，或再經(jīng)淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使結(jié)合態(tài)維生素游離出來，再將它們從食物中提取出來。（二）維生素C通常采用草酸、草酸—醋酸、偏磷酸—醋酸溶液直接提取。三、維生素C的測(cè)定（一）概述：結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)：2.生理功能及在食品工業(yè)上應(yīng)用(1)參與神經(jīng)介質(zhì)、激素的生物合成(2)是一種營(yíng)養(yǎng)添加劑、強(qiáng)化劑、抗氧化劑。（二）2，6一二氯靛酚滴定法1.原理1）還原型Vc能定量地還原2、6-二氯靛酚（染料）2）2、6-二氯靛酚在中性或堿性溶液中顯藍(lán)色，在酸性溶液中顯粉紅色；被還原后不顯色。還原型Vc+染料（顯色）→氧化型Vc+被還原的染料（不顯色）2.儀器(1)組織搗碎機(jī)。(2)25mL、10mL滴定管。(3)100ml具塞量簡(jiǎn)。

3.試劑(1)20g/L草酸溶液。(2)10g／L草酸溶液。(3)淀粉指示劑：取1g可溶性淀粉，加10mL冷水調(diào)成稀粉漿，倒入正在沸騰的100ml水中，攪拌至透明，放冷備用。(4)60g/L碘化鉀溶液。(5)0.1000mol／LKIO3標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取3.5670g經(jīng)烘干的基準(zhǔn)碘酸鉀，溶解定容1L。(6)0.00lmol/LKIO3標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(7)維生素C標(biāo)準(zhǔn)貯備液；稱取純L-抗壞血酸粉末20mg，用10g/L草酸溶解，定容100