油菜根系分泌物中氨基酸、油菜菌核的趨化性研究

油菜根系分泌物中氨基酸、油菜菌核的趨化性研究

具有運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)菌在膜表面上有幾種特殊的化學(xué)受體。細(xì)菌可以通過(guò)檢測(cè)廠外環(huán)境中化合物濃度的變化，并通過(guò)神經(jīng)信號(hào)傳輸系統(tǒng)將反應(yīng)的化學(xué)信息轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)。此外，該信號(hào)可以控制細(xì)菌鞭毛的運(yùn)動(dòng)方向，并產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的趨勢(shì)運(yùn)動(dòng)。趨化性是微生物的一種定向移動(dòng),是其適應(yīng)環(huán)境變化而生存的一種基本屬性,它使微生物具有尋找食源和逃避毒性環(huán)境的能力,因而在生存上具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。有運(yùn)動(dòng)能力的微生物對(duì)多種化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度產(chǎn)生趨向或逃避響應(yīng)的行為即趨化性(Chemotaxis)。自Pfeffer實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的趨化性以來(lái),人們已經(jīng)從理論和實(shí)驗(yàn)方面對(duì)細(xì)菌趨化性進(jìn)行了一系列的研究,取得了許多重要的結(jié)果。細(xì)菌的趨化性在許多研究領(lǐng)域中具有重要意義,國(guó)內(nèi)外的研究表明,在生物除污、土壤環(huán)境保護(hù)與監(jiān)測(cè)、土壤修復(fù)以及微生物采油等領(lǐng)域已取得不同程度的進(jìn)展。目前利用趨化性對(duì)植物促生根際細(xì)菌(PGPR)的促生生防作用機(jī)理的研究不多見(jiàn)。根部是分離、篩選PGPR菌株的重要部位,PGPR菌株成功定殖根表是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵,當(dāng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存在一定濃度梯度時(shí),細(xì)菌出于適應(yīng)環(huán)境的本能而表現(xiàn)出趨化性,Roberts等研究認(rèn)為趨化性有助于Enterobactercloacae在黃瓜根際的定殖。微生物在根部定殖已成為衡量各種微生物—植物系統(tǒng)的一個(gè)重要參數(shù),成為揭示有益微生物的根際生態(tài)學(xué)特征、提高根際適應(yīng)性和增產(chǎn)效果必不可少的研究?jī)?nèi)容。本研究進(jìn)行了枯草芽孢桿菌Tu-100對(duì)油菜根系分泌物所含氨基酸的趨化性研究。這將為進(jìn)一步研究根際選擇效應(yīng)的機(jī)理和改進(jìn)植物促生根際細(xì)菌的應(yīng)用方法提供試驗(yàn)依據(jù),同時(shí)為將來(lái)進(jìn)一步研究植物促生根際細(xì)菌在改善油菜營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和土傳病害生物防治等方面的研究奠定一定的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1粉包中構(gòu)建基因型弱化因素枯草芽孢桿菌Tu-100由農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室從油菜品種“中油821”根際分離得到,它對(duì)油菜的生長(zhǎng)有一定的促生作用,同時(shí)對(duì)油菜菌核病也有一定的防治效果。1.1.2試驗(yàn)品種油菜品種為“中雙11號(hào)”由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所油菜育種研究室提供。1.2方法1.2.1molm-2s-1培養(yǎng)模式用0.1%HgCl2浸泡油菜種子3min,進(jìn)行種子表面消毒,用無(wú)菌水洗滌7次,在25℃條件下催芽,48h后,將根長(zhǎng)2~3cm油菜芽轉(zhuǎn)移至500ml裝有霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液(使用前,121℃滅菌20min)的三角瓶中(每個(gè)三角瓶上種1株油菜),重復(fù)3次。在22℃、光照周期為12h、光照強(qiáng)度150μmolm-2s-1條件下培養(yǎng)30d。將生長(zhǎng)30d的油菜苗取出,3個(gè)三角瓶中余下的溶液在5000rmin-1下離心5min,將上清液冷凍真空干燥,濃縮至1ml,在-20℃下保藏備用。1.2.2油根的收獲將水培生長(zhǎng)30d的油菜苗上的完整根系剪下,60℃干燥、備用。1.2.3油菌核的采集在油菜收獲后,選擇被油菜菌核病侵害的油菜莖稈,用小刀撇開(kāi)莖稈,從中采集油菜菌核,放入尼龍網(wǎng)袋風(fēng)干、室溫條件下保藏備用。1.2.4氨基酸衍生物檢測(cè)采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定。色譜條件為:色譜柱,DiamonsilC18(150mm×4.6mm,5μm)。流動(dòng)相,A:NaAc緩沖溶液0.233molL-1,pH4.95,B:乙腈水溶液。波長(zhǎng),248nm。流速,1.0mLmin-1。柱溫,37℃,進(jìn)樣量,10μl。用HPLC測(cè)定氨基酸需要衍生,并用熒光檢測(cè)器熒光。測(cè)定出的各種氨基酸的含量分別除3,得到的結(jié)果為每種氨基酸μg株-1。1.2.5篩選趨化值及引物采用燒杯法。先將枯草芽孢桿菌Tu-100菌株在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl5g,蒸餾水1000ml,固體培養(yǎng)基加1.8%瓊脂粉)培養(yǎng)液中搖床培養(yǎng)(28℃、160rmin-1)12h,再以10%的接種量接種至LB培養(yǎng)液中,搖勻,繼續(xù)培養(yǎng)12h。取菌液離心(6000rmin-1)5min,菌體用生理鹽水懸浮,振蕩器振動(dòng)1min使其均勻,此懸浮液含菌量為≥1×108個(gè)ml-1,將該懸浮液用生理鹽水稀釋至≥1×106個(gè)ml-1,備用。將直徑為1cm的透析袋在生理鹽水中煮沸2min,下部封口,加入1.0g油菜根或油菜菌核,上部封口,固定在200ml燒杯中央,燒杯中加有200ml生理鹽水,透析袋外側(cè)與燒杯內(nèi)側(cè)間距為3cm,燒杯中加入1ml菌懸液并混合均勻,28℃靜止60min。自透析袋外側(cè)和燒杯內(nèi)側(cè)分別取lml菌懸液,用生理鹽水稀釋10倍,取100μl涂LB平板,28℃培養(yǎng)48h,計(jì)菌落數(shù)。透析袋外側(cè)菌數(shù)與燒杯內(nèi)側(cè)的菌數(shù)之比為趨化值(Che)。在透析袋中加入1.0ml生理鹽水代替油菜根或油菜菌核,這時(shí)Che=1,以此為CK;Che>1時(shí),所測(cè)樣品為趨引劑;Che<1時(shí),所測(cè)樣品為趨避劑。以上CK和處理各重復(fù)3次。1.2.6培養(yǎng)基氨基酸nh4、tu-100添加量、10.5mol-2po410.5mg細(xì)菌感染檢測(cè)采用平板趨化法。菌體的培養(yǎng)同本文1.2.5節(jié)所述。將培養(yǎng)好的菌液1.0ml經(jīng)6000rmin-1離心5min,生理鹽水洗2次,加入1.0ml的生理鹽水混勻,制成菌體懸浮液備用。采用游動(dòng)平板法測(cè)定,即在含0.15%瓊脂的平板上(10mmolL-1KH2PO4,1mmolL-1(NH4)2SO4,5molL-1MgSO4,0.6%NaCl,無(wú)碳源),距離中心3cm處加入從油菜根系分泌物所測(cè)定到的氨基酸作為碳源(濃度為0.1molL-1,加入量為10μl),或在距離中心2cm處放入油菜根或菌核,同時(shí)在平板中心接種經(jīng)處理備用的枯草芽孢桿菌Tu-100,接種量為10μl,每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)。培養(yǎng)皿平板僅含0.15%的瓊脂,帶有鞭毛的細(xì)菌能在上移動(dòng)。28℃條件下,72h內(nèi)連續(xù)觀察枯草芽孢桿菌Tu-100向各種氨基酸和油菜根或菌核移動(dòng)距離。2結(jié)果2.1治理前后油茶根系混合物中氨基酸組分的測(cè)定油菜根系分泌物氨基酸測(cè)定結(jié)果如表1所示。從表1可看出,油菜根系分泌物所測(cè)定到的16種氨基酸中,谷氨酸含量最高13.1μg株-1,絲氨酸含量最低0.5μg株-1。2.2枯草芽孢桿菌k和油茶根趨化性測(cè)定在28℃條件下,燒杯法測(cè)得枯草芽孢桿菌Tu-100對(duì)油菜根和油菜菌核的趨化值都大于1,為正趨化性(表2),從表2可以得出CK的趨化值Che平均值為1.01,油菜根的趨化值Che平均值為1.85,油菜菌核的趨化值Che平均值為1.21,油菜根的趨化性要大于油菜菌核,差異顯著。采用平板法測(cè)定菌株對(duì)油菜根和菌核的趨化性,在48h觀察枯草芽孢桿菌Tu-100向油菜根和菌核移動(dòng)距離分別為1.1和0.7cm(表3、圖1和圖2)。這同燒杯法的結(jié)果是一致的,即油菜根的趨化性要大于油菜菌核,差異顯著。2.3枯草芽孢桿菌tu-100向氨基酸和組氨酸移動(dòng)狀態(tài)在28℃條件下,用平板法測(cè)定菌株對(duì)氨基酸的趨化性,48和72h觀察枯草芽孢桿菌Tu-100向各種氨基酸移動(dòng)距離,結(jié)果見(jiàn)表4。在48h時(shí)觀察到枯草芽孢桿菌Tu-100向谷氨酸移動(dòng)的狀態(tài)(圖3),在72h時(shí)觀察到枯草芽孢桿菌Tu-100向組氨酸移動(dòng)的狀態(tài)(圖4)。谷氨酸在油菜根系分泌物中含量最高(13.1μg株-1),但趨化性最好的為組氨酸,72h能平均移動(dòng)3.06cm,對(duì)脯氨酸、精氨酸、天門(mén)冬氨酸和谷氨酸也表現(xiàn)出不同程度的趨化性(表4),對(duì)其他11種氨基酸沒(méi)有表現(xiàn)出趨化性。3枯草芽孢桿菌tu-100對(duì)柴油菌核的趨化性在本研究油菜根系分泌物所測(cè)定出的17種氨基酸中,枯草芽孢桿菌Tu-100僅對(duì)5種氨基酸有趨化性,趨化性的強(qiáng)弱依次為組氨酸>脯氨酸>精氨酸>天門(mén)冬氨酸和谷氨酸。氨基酸作為碳源滴加入培養(yǎng)皿平板之后,有微量氨基酸將向四周擴(kuò)散,加上Tu-100鞭毛的運(yùn)動(dòng),從而形成了趨化性。有些氨基酸不能形成趨化性,可能是由于Tu-100不能利用它們。在有趨化性的5種氨基酸中,強(qiáng)弱不一,可能與它們擴(kuò)散的程度或是Tu-100對(duì)它們的利用率有關(guān),這有待深入研究。同時(shí)Tu-100對(duì)油菜根也有趨化性,因根中可能含有以上5種氨基酸或其他某些碳源,這對(duì)于植物促生根際細(xì)菌(PGPR)菌株枯草芽孢桿菌Tu-100能在油菜根際定殖和促生作用提供了依據(jù)?？莶菅挎邨U菌Tu-100對(duì)油菜菌核的趨化性,將有助于枯草芽孢桿菌Tu-100在油菜菌核上定殖,這對(duì)能否對(duì)油菜菌核的萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用,從而達(dá)到生物防治的目的,要進(jìn)行更深入的探究。通過(guò)燒杯法和平板法都證明枯草芽孢桿菌Tu-100對(duì)油菜根的趨化性要大于油菜菌核,這可能是油菜菌核自身為休眠狀,不產(chǎn)生分泌物,僅僅靠菌核表面所帶有的微量碳源,如氨基酸、有機(jī)酸等,到底是何種物質(zhì)在起作用有待進(jìn)一步研究。不同菌株在不同植物和土壤環(huán)境等條件下沿根散布的機(jī)制各異,不一定是某一種機(jī)制始終起決定作用,每一種因素的相對(duì)作用可能決定于包括根生長(zhǎng)速率、土壤質(zhì)地、水分特征在內(nèi)的各種變異因子及引入細(xì)菌的生長(zhǎng)速率、運(yùn)動(dòng)性、趨化性和細(xì)胞表面性質(zhì)等。Gamliel和Katam研究認(rèn)為趨化性有助于熒光假單胞桿菌在根際的定殖。關(guān)于引入細(xì)菌沿根分布的機(jī)制,Bowen和Rovira提出了四種可能的方式,即細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、生長(zhǎng)根的帶動(dòng)作用、向下水流的作用和轉(zhuǎn)運(yùn)作