基于pseudom縮影的chea基因在硫磷降解中的應(yīng)用

基于pseudom縮影的chea基因在硫磷降解中的應(yīng)用

微生物對(duì)環(huán)境污染物的分解效果不僅取決于分解能力本身，還取決于生物的適應(yīng)性以及隨后的微生物和本土微生物之間的相互作用。細(xì)菌的趨化性(chemotaxis)是細(xì)菌響應(yīng)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)梯度的移動(dòng),是細(xì)胞對(duì)碳源、能源競爭的一種表現(xiàn)。近幾年來,細(xì)菌趨化性與降解性之間的關(guān)系研究開始受到科研工作者的關(guān)注,許多研究表明細(xì)菌的趨化性和降解特性之間存在密切關(guān)系。趨化性可以使降解菌株有效地感應(yīng)到污染物,增加污染物周圍的細(xì)菌密度,提高污染化合物的生物降解性。而且,趨化性可以增加細(xì)菌尋找合適碳源和氮源的機(jī)會(huì),使細(xì)菌在有限碳、氮源環(huán)境中與土著微生物的競爭中表現(xiàn)出優(yōu)勢。趨化反應(yīng)過程中負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因相對(duì)保守,研究也比較成熟,在大腸桿菌(Escherichiacoli)、Salmonellaserovar、Pseudomonasaeruginosa、P.putida、Hizobiumleguminosarum和Rhodobactersphaeroides等菌屬中都進(jìn)行了許多研究,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程主要通過甲基酯酶(CheB)和甲基轉(zhuǎn)移酶(CheR)調(diào)節(jié)趨化受體蛋白(MCPs)(methyl-acceptingchemotaxisproteins)的甲基化來影響組氨酸激酶(CheA)的磷酸化,再來調(diào)節(jié)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(CheY)的磷酸化,而CheY與鞭毛馬達(dá)開關(guān)結(jié)合,直接決定著鞭毛的旋轉(zhuǎn)方向。本文以本實(shí)驗(yàn)室分離到的一株高效甲基對(duì)硫磷(MP)的降解菌株P(guān).putidaDLL-1為研究對(duì)象,通過游動(dòng)平板法,發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)MP同樣具有趨化性。通過基因打靶使DLL-1菌株中單拷貝的趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因(cheA)失活,驗(yàn)證該趨化突變株在土壤原位條件下對(duì)MP的降解能力的變化,研究趨化性和降解性之間的關(guān)系,闡明趨化性在農(nóng)藥原位降解中的作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇和顆粒本實(shí)驗(yàn)中使用的菌株和質(zhì)粒見表1。1.1.2藥物、試劑和儀器限制酶、堿性磷酸酶、T4DNA連接酶、LATaq酶購自TaKaRa公司,抗生素購自江蘇創(chuàng)瑞公司,DNA片段純化回收試劑盒購自Genbase公司,所用引物由TaKaRa公司合成,氣相色譜專用試劑均為色譜純,其他試劑均為分析純。80%的MP原藥購自浙江嘉化集團(tuán)股份有限公司。氣相色譜型號(hào)為GC-14B。1.1.3配套藥物的添加①無機(jī)鹽、LB培養(yǎng)基配方見參考文獻(xiàn);②LBM培養(yǎng)基:LB中加100μg/mL的MP;③SLB培養(yǎng)基:LB中添加5%的蔗糖。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要再添加相應(yīng)的抗生素,如:氨芐青霉素(Amp)為100μg/mL,卡那霉素(Km)為50μg/mL,鏈霉素(Str)為50μg/mL。④趨化培養(yǎng)基:每升含(NH4)2SO41.0g,K2HPO40.7g,KH2PO40.3g,MgSO40.2g,NaCl0.5g,pH7.0,瓊脂糖0.2%。⑤趨化緩沖液:40mmol/LK3PO4,0.05%甘油,10mmol/LEDTA,pH7.0。1.2細(xì)菌培養(yǎng)E.coli和P.putida分別于LB培養(yǎng)基中37℃和30℃培養(yǎng)。1.3dna的制備、純化細(xì)菌總DNA的制備、酶切、酶連、載體脫磷、E.coli普通感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取等操作方法見參考文獻(xiàn);DNA的回收純化按照試劑盒說明書進(jìn)行;DNA測序委托TaKaRa公司完成;實(shí)驗(yàn)中所用的引物及PCR擴(kuò)增條件列于表2。1.4cma和pmwd擴(kuò)增參照模式菌株P(guān).putidaKT2440的全基因組序列,根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼組氨酸激酶磷酸化的基因(cheA)引物(表2),擴(kuò)增目的條帶cheA。將擴(kuò)增的cheA片段與pMD18-T載體連接獲得pMDA。以pSC123為模板,引物KF和KR擴(kuò)增出含啟動(dòng)子的Km抗性基因片段,兩端同時(shí)引入BglⅡ酶切位點(diǎn),連接到pMD18-T載體上,命名為pMDK。XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切pMDA,將2kb左右的cheA大部分片段連到同樣酶切的pWM91質(zhì)粒載體上,轉(zhuǎn)化E.coliDH5αλpir獲得pWMA。用BglⅡ分別單酶切pWMA和pMDK,分別回收10kb的pWMA線性片段和1kb的Km片段,將Km片段連接到pWMA的BglⅡ酶切位點(diǎn),獲得cheA片段中間插入Km基因的同源重組打靶載體pAK,最終將pAK轉(zhuǎn)入E.coliDH5αλpir。圖1為同源重組載體構(gòu)建的具體路線。1.5菌株的制備和膜的制備將供體菌、受體菌、輔助菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期,8000r/min離心回收菌體,用無菌水洗滌1次,濃縮后按1∶1∶1混合3種菌液于微孔濾膜(0.22μm)上,過濾除去濾液,置于不含抗生素的LB培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng),24h后用無菌水洗下菌體,直接涂布于含100μg/mLAmp、50μg/mLKm和50μg/mLStr的LB平板上。1.6細(xì)菌趨化反應(yīng)游動(dòng)平板分析法(Swarmplateassay):取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌培養(yǎng)液,收集菌體,用趨化緩沖液洗滌,懸浮于趨化緩沖液中,滴加10μL(約106個(gè)細(xì)胞)于以受試底物(100mg/kg的MP)為唯一碳源的趨化平板中央,培養(yǎng)一定時(shí)間,如果細(xì)菌對(duì)所測化合物產(chǎn)生趨化反應(yīng),就會(huì)在平板上形成很大的菌落圈。1.7培養(yǎng)液中od值的測定將兩個(gè)菌株分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,調(diào)節(jié)使OD600值一致,分別取1mL培養(yǎng)液接種于裝有等體積LB的三角瓶中,震蕩培養(yǎng),每隔一段時(shí)間取3mL培養(yǎng)液用分光光度法測定OD值。本試驗(yàn)重復(fù)3次。1.8接種1d樣品的制備取菜園土,風(fēng)干,過20目篩,100g滅菌與100g未滅菌土壤中各加入50mg/kg的MP。將菌株DLL-1與DAK分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,調(diào)節(jié)OD600值一致,用無菌水洗滌菌體1次。接菌處理中分別接種DLL-1與DAK菌體,接菌量盡量保持一致(通過平板計(jì)數(shù)確定),接種量控制在105～106個(gè)/g土,分別于12h、24h、36h、48h、3d和5d取樣測定農(nóng)藥濃度。本試驗(yàn)重復(fù)3次。MP的氣相色譜檢測:每個(gè)處理取10g土,加2倍體積的丙酮,劇烈震蕩3min,靜置過夜,取2mL揮發(fā)定容至1mL,去水相,過無水Na2SO4柱,收集流出的丙酮液體,氣相色譜檢測。2結(jié)果和分析2.1趨化圈的生長菌株DLL-1在100μg/mL的MP為唯一碳源的趨化培養(yǎng)基中顯示出明顯的趨化性,4h、36h、3d的趨化情況如圖2-A,4h時(shí)趨化圈不夠明顯,但肉眼可觀察到(照片顯示不出),通過圖2-B中數(shù)據(jù)顯示,隨著時(shí)間的延長,趨化圈也隨之增大。隨著趨化物濃度的升高,趨化圈隨之明顯擴(kuò)大。當(dāng)MP濃度達(dá)到500μg/mL時(shí),趨化圈開始明顯減小,可能是高濃度的MP導(dǎo)致菌株出現(xiàn)負(fù)趨化。2.2同源重組單交換子的篩選成功地在菌株DLL-1染色體中擴(kuò)出2.2kb左右目的條帶cheA片斷,測序結(jié)果表明該片段與KT2440中cheA基因同源性在99%以上。通過三親接合的方法將同源重組打靶載體pAK轉(zhuǎn)入到受體菌DLL-1中,因pAK為R6K復(fù)制位點(diǎn)不能在DLL-1中自主復(fù)制,在Str、Km和Amp三抗平板上篩選出來的即為同源重組單交換子。將同源重組單交換子在無抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,稀釋涂布于含5%蔗糖的Str和Km平板(SLB)上,挑取能生長的具有雙重抗性的單菌落即為陽性同源重組雙交換子,即為cheA基因被Km抗性基因插入失活的突變株,命名為P.putidaDAK。2.3藥代動(dòng)力學(xué)pcr擴(kuò)增結(jié)果提取P.putidaDAK總DNA,分別用引物AF和KR、AF和KF、KF和AR擴(kuò)增(圖3-A),擴(kuò)增結(jié)果如圖4-B。由于引物AF和AR、KF和KR分別設(shè)計(jì)在cheA和Km基因片段上,因此,通過PCR擴(kuò)增能夠確定Km基因是否插入到cheA位點(diǎn)。用引物AF和KR擴(kuò)增出2.8kb左右的條帶,AF和KF沒有擴(kuò)增出條帶,KF和AR擴(kuò)增出1.4kb左右的條帶,PCR結(jié)果證明了Km基因確實(shí)插入到cheA基因位點(diǎn)。2.4dak對(duì)mp的趨化性圖4為野生菌株DLL-1和突變菌株DAK生長曲線。從圖中可以看出DAK中cheA基因突變后和DLL-1菌株在LB培養(yǎng)基中生長情況基本一致,表明Km基因插入到cheA位點(diǎn)對(duì)受體菌的生長速率沒有顯著影響。將趨化突變株DAK與野生株DLL-1按同等條件接種到含100mg/kgMP的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,每隔1h取樣,過氣相色譜檢測殘留的MP的量。結(jié)果顯示(圖5),野生和突變株在液體搖瓶中,對(duì)農(nóng)藥的降解效率幾乎沒有差異,說明在動(dòng)態(tài)環(huán)境中,菌體與趨化物充分接觸,對(duì)其降解能力影響不大。采用游動(dòng)平板法驗(yàn)證突變株DAK對(duì)MP的趨化性。圖6為12h、36h和3d對(duì)MP的趨化性,結(jié)果表明突變株DAK喪失了對(duì)MP的趨化性。菌株DAK中cheA基因的失活阻礙了組氨酸激酶的磷酸化,中斷了整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,阻斷了鞭毛的運(yùn)動(dòng),導(dǎo)致菌體不能游向趨化物,喪失了趨化性。2.5趨化突變株對(duì)mp的降解效率和降解速率的影響將趨化突變株DAK與野生株DLL-1按同等條件接種到含50mg/kgMP的未滅菌和滅菌的土壤中,每隔一定時(shí)間取樣,過氣相色譜柱檢測殘留的MP的量。結(jié)果顯示(圖7),DLL-1對(duì)MP的降解效果明顯,3d后幾乎全部降解了,而同等條件下,趨化突變株DAK和DLL-1相比,降解效率不如野生菌株快,在未滅菌土壤中,36h內(nèi)其降解速率比原始菌株低約20%,在滅菌土壤中低約30%。農(nóng)藥在滅菌的土壤中的降解速率低于未滅菌土壤,這跟土壤中存在的有機(jī)質(zhì)含量以及其他菌群有關(guān),有些土著微生物對(duì)農(nóng)藥有一定的降解作用。以上表明在土壤中,菌株趨化性的喪失對(duì)MP的降解是有一定影響的。對(duì)于野生菌株而言,菌株的趨化特性對(duì)農(nóng)藥的降解能力有促進(jìn)作用,要想趨化突變株達(dá)到同樣的降解效果,必須加大施菌量。3生物可再生物酶系統(tǒng)的檢測細(xì)菌的趨化性在化學(xué)污染物的原位降解中發(fā)揮重要作用。Witt等最早在實(shí)驗(yàn)室微宇宙系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)趨化性能促進(jìn)細(xì)菌對(duì)沉積物中四氯甲烷污染物的生物修復(fù)。Marx等通過比較野生菌株P(guān).putidaG7、趨化突變株和非游動(dòng)菌株對(duì)萘的降解,發(fā)現(xiàn)野生菌株的降解速率最快,如果要同樣達(dá)到相同的降解效果,趨化突變株的細(xì)胞濃度要比高出幾倍。Pedit同樣證實(shí)了非趨化性菌株要達(dá)到趨化性菌株對(duì)萘相同的降解效果時(shí),其數(shù)量也須高出幾倍。Lanfranconi等從汽油污染的土壤中分離到一株脂肪烴降解菌Flavimonasoryzihabitans,該菌對(duì)分離源土壤中存在的十六烷烴等鏈烷烴具有趨化性,結(jié)果表明趨化性在污染物的降解過程中有重要作用,有利于降解菌株與底物之間的接觸,增強(qiáng)生物降解效果。Ortega-Calvo等首次評(píng)價(jià)了根圈中多環(huán)芳烴(萘、菲、蒽及芘)降解菌的趨化性在污染物植物修復(fù)系統(tǒng)中的作用。他們在煤炭和石油污染的土壤中分離了20余株多環(huán)芳烴趨化性降解菌株,研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的趨化性使根圈中降解性細(xì)菌數(shù)量增加,提高了污染物的生物可利用性,促進(jìn)了根圈中多環(huán)芳烴的降解。P.putidaDLL-1能以MP為唯一碳源、氮源生長,通過游動(dòng)平板法發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)MP表現(xiàn)出很強(qiáng)的趨化性,隨著農(nóng)藥濃度的增加,趨化能力也增強(qiáng)