2012《醫(yī)學細胞生物學》設計型實驗

PAGE4-設計型實驗設計報告實驗項目：動物細胞融合細胞核的分離與鑒定小組成員：班級：醫(yī)學細胞生物學設計型實驗設計報告姓名班級學號評分實驗項目：動物細胞融合實驗原理：細胞融合，即在自然條件下或人工方法（生物的、物理的、化學的），是兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的過程。有性繁殖時發(fā)生的精、卵細胞結合是正常的細胞融合。誘導融合的方法很的，常用的主要有生物法（滅活的仙臺病毒）、化學法（聚乙二醇）、物理法（電泳）。滅活的仙臺病毒的磷脂外衣與動物細胞的膜十分相似，且病毒外殼上的某些糖蛋白可能還有促進細胞融合的功能。PEG是一種去垢劑，能破壞互相的接觸的磷脂雙分子層，從而是相互接觸的細胞膜之間的融合，形成一個雙核或多核的細胞。目前用得最廣泛的是聚乙二醇，因為它易得、簡便、且融合效果穩(wěn)定。實驗步驟：（1）50%PEG夜的制備稱取一定量的PEG（Mv=4000）放入燒杯中，沸水浴加熱，使之溶化，待冷卻至0℃時，加入等體積預熱至50℃的無血清1640液混勻，置于37℃中保溫備用。（3）大白鼠細胞的制備左手抓老鼠，將大白鼠頭部向下，右手持尖頭鑷子輕輕插入眼眶中，然后將眼球向外拉出。①將流出的血置于事先盛有Alever溶液的燒杯中制成1：4的懸液。②取1ml的懸液加入4ml的生理鹽水，混勻平穩(wěn)之后，800r/min離心3min,棄去上清液，再按上述條件離心2次。③最后棄去上清液加hanks液4ml離心1次，再棄去上清液后，將離心管倒置于濾紙上，盡量流盡剩余液體（液體殘余會改變PEG濃度）（4）誘導與溫育用手指輕彈離心管底壁，是沉淀物松散，然后吸取50%的PEG0.5ml,在37攝氏度水浴中，緩慢逐滴加入離心管中（90s以內），邊加邊搖動離心管，使之與細胞混合均勻，然后加入8-10ml左右hanks液輕輕吹打（防止融合的細胞分開）混勻，放入37℃水浴箱中靜置5min（以稀釋PEG），之后離心棄去上清液，加hanks液5ml離心1次，棄上清液，之后加入含小牛血清的1640培養(yǎng)液，在37℃的水浴中培養(yǎng)30分鐘。（5）染色觀察分別于溫浴5min、10min、20min、30min的時段取細胞懸液一滴制成臨時裝片，以0.2%次甲基蘭染液染色三分鐘后，蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下進行觀察。實驗結果分為五個階段：兩個細胞的細胞膜之間相互接觸粘連相接觸的兩細胞膜破口粘合。形成細胞膜通道兩細胞之間的細胞質相通，形成細胞質通道通道擴大，兩細胞連成一體細胞核并完成，形成一個含有兩個或多個核的圓形細胞均能在不同時間的臨時裝片上看到預期結果：在顯微鏡下可看見有2個或2個以上的大白鼠細胞膜融合在一起，形成1個異核體細胞。細胞融合率的計算：融合率是指在顯微鏡的視野內，已發(fā)生融合的細胞，其細胞核的總數與此視野內所有細胞的細胞核總數之比。通常用百分數來表示，且進行多個視野測定，求平均值，在統(tǒng)計較為準確。計算公式：融合率=×100%注意事項：1、pH為8.0-8.2是影響細胞融合與否的關鍵因素之一2、制備50%PEG保溫在37-39℃水浴中，不然冷卻后晶體析出，且細胞融合對溫度很敏感。3、為觀察細胞融合的形態(tài)需對細胞進行染色除詹姆斯綠外還可用HE染色。4、在離心管中加入PEG前，一定要將離心管倒置于濾紙上，流盡剩余液體，否則殘留液會改變PEG液的濃度。5、PEG的處理時間:處理時間越長，融合效果越好,但對細胞的毒害也就越大。故一般將處理時間限制在1分鐘之內。教師：日期：實驗儀器、設備、器具表實驗項目：動物細胞融合表1—1實驗儀器表名稱規(guī)格、型號數量說明顯微鏡1觀察尖頭鑷子1夾取、染色等水浴箱1恒溫處理離心機1離心載玻片/蓋玻片4制作裝片10ml離心試管10裝待離心液10ml量筒2量取試劑大燒杯1盛裝廢棄液體實驗項目：動物細胞融合表1—2實驗材料和試劑表名稱規(guī)格用量說明大鼠1聚乙二醇Mv=4000誘導劑hanks液緩沖液，等滲液0.2%次甲基蘭染液染色劑RPNI1640培養(yǎng)液10%滅活小牛血清和無血清兩種營養(yǎng)液Alever溶液抗凝暫時保持細胞完整醫(yī)學細胞生物學設計型實驗設計報告姓名班級學號評分實驗項目：細胞核的分離與鑒定實驗原理：細胞核：它是由核膜（nuclearmembrane）、核骨架（nuclearscaffold）、核仁(nucleolus)幾部分組成。細胞核的主要構造為核膜，是一種將細胞核完全包覆的雙層膜，可使膜內物質與細胞質、以及具有細胞骨架功能的網狀結構核纖層分隔開來，其上特殊物質可被染色劑染色顯現出顏色。核體的制備:核體是指含有少量細胞質并由質膜包裹的細胞核。分離細胞核的可用方法有吸出法、原生質體破裂法、差速離心法排和排除法。差速離心法是根據細胞內各種細胞結構的比重和大小不同，因而在同一離心場內的沉降速率不同從而將細胞內的結構分級分離出來。本實驗就采用差速離心法。細胞核的鑒定，甲苯胺藍可使細胞核呈藍紫色實驗步驟：（1）、斷頭法處死小白鼠，手提尾部使腹內血液盡量流出，迅速解開其腹腔取出肝臟，去出結締組織，剪成小塊，盡快置于盛有0.9%NaCl的燒杯中。反復洗滌盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。（2）、將濕重為1g的肝組織放入燒杯中，用量筒取8ml預冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于燒杯中，盡量剪碎肝組織后全部加入。（3）、將剪碎的肝組織導入勻漿管中，使勻漿器下端侵入盛有冰塊的器血中，左手持，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉動研磨多次，直至看不到明顯組織塊。用8層紗布過濾于勻漿管中，然后制備一張涂片①，自然干燥。（4）、將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機以2500r/min離心15min,棄去上清液，大約剩余1ml上清液，然后取上清液制備一張涂片①，自然干燥。將殘留液體用氣管吹成懸液，滴一滴于干凈的載蓋玻片上，制成涂片②，自然干燥。（5）、固定，將制備好的涂片放入70%的乙醇中固定5min,晾干。（6）、染色，分別在涂片①②上滴加1%甲苯胺藍染色液，染色5-7min（7）、流水沖去染液，晾干（8）、鏡檢顯微鏡下觀察并分析注意事項：（1）、在染色時時間一定要足夠，否則染色不完全會得到不理想的結果。（2）、去掉胞質的核體貼附能力弱，應注意在用固定、染色時盡量避免胞核的脫落。預期結果：在低倍鏡下找到標本，再換高倍鏡，可以觀察到經.1%甲苯胺藍染液染色的小白鼠肝細胞的細胞核已經游離出來，被染成藍紫色，圓形，即細胞核。教師：日期：實驗儀器、設備、器具表實驗項目：動物細胞細胞核的分離與鑒定表2—1實驗儀器表名稱規(guī)格