小鼠便秘模型建模方法的初步探討

小鼠便秘模型建模方法的初步探討

抗教學(xué)藥物的研發(fā)滯后便秘是臨床上常見(jiàn)的癥狀，指大便隱匿于腸道超過(guò)48小時(shí)的大便，大便中的水分流失過(guò)多，糞便失去過(guò)多，大便結(jié)構(gòu)干燥，狹窄的肛門(mén)管容易穿越肛門(mén)，運(yùn)輸時(shí)間延長(zhǎng)，排便次數(shù)減少，因此很難立即排便。通常，3.5天或更長(zhǎng)時(shí)間。我國(guó)慢性便秘發(fā)病率高達(dá)20%,約有50%~60%的人曾經(jīng)受到便秘的困擾,以老年人、婦女及兒童最常見(jiàn)。便秘時(shí),宿便堆積在腸道里,不斷產(chǎn)生各種毒氣、毒素,造成腸內(nèi)環(huán)境惡化、腸胃功能紊亂、內(nèi)分泌失調(diào)、新陳代謝紊亂等,嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。便秘不僅成為肛腸病發(fā)病的誘因,還可加重許多全身性疾病。而目前,抗便秘藥物的研發(fā)仍顯得比較滯后,便秘動(dòng)物模型的建立明顯不足,缺乏對(duì)藥物作用機(jī)理的深入研究。因此,確立一種簡(jiǎn)單、高效并且與人類(lèi)便秘特征較為相似的動(dòng)物模型迫在眉睫。本研究參考了相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)四種小鼠便秘模型的建立方法進(jìn)行了比較,旨在找到更加簡(jiǎn)單易行、高效的便秘造模方法,為便秘治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)雄性昆明純種小白鼠40只,體重18~22g,由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(清潔級(jí)),均自由飲水、進(jìn)食,飼養(yǎng)室溫(22±2)℃。1.2藥品、試劑和儀器復(fù)方地芬諾酯片:每片含鹽酸地芬諾酯2.5mg、硫酸阿托品25μg,長(zhǎng)春長(zhǎng)紅制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):22022037,臨用前配制成所需濃度的復(fù)方地芬諾酯混懸液;北海硫糖鋁咀嚼片0.25g*100片,北海陽(yáng)光藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào):45021553;阿拉伯樹(shù)膠粉由成都科龍化工試劑廠進(jìn)口分裝,批號(hào):20030106;活性炭(粉末)北京木材加工廠生產(chǎn);炭粉液(墨汁,首粒黑便指示劑)的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取阿拉伯樹(shù)膠100g,加水400ml配成0.25%透明溶液,再將活性碳粉50g加至上述溶液中煮沸3次,待溶液冷卻后加水定容至500mL,于4℃冰箱保存,臨用前搖勻,并加入等量蒸餾水,制得碳粉液(墨汁)待用。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1動(dòng)物的單次給藥和人工聯(lián)合灌胃10只小鼠隨機(jī)分為復(fù)方地芬諾酯組(8只)和陰性對(duì)照組(2只)。實(shí)驗(yàn)前1天記錄10只動(dòng)物首粒排黑便時(shí)間和在2h內(nèi)排便的粒數(shù)及重量,并將各組小鼠禁食不禁水16h,于次日測(cè)定時(shí),模型組給予復(fù)方地芬諾酯混懸液(5mg/kg)灌胃,陰性對(duì)照組給予等容量蒸餾水;30min后再給碳粉液指示劑,動(dòng)物單籠喂養(yǎng),正常飲水和進(jìn)食,從灌墨汁開(kāi)始記錄每只動(dòng)物首粒排黑便時(shí)間和在2h內(nèi)排糞便的粒數(shù)及重量。1.3.2單次飲水方式10只小鼠隨機(jī)分為禁水不禁食組(8只)和陰性對(duì)照組(2只)。試驗(yàn)前1天記錄小鼠首粒排黑便時(shí)間和在2h內(nèi)排便的粒數(shù)及重量,限制水量:于第一、二天分別給予前五日平均水量的1/6,第三至六日給1/3,取整數(shù)值。給水方法:對(duì)限水小鼠采用普通飲水瓶手持輔助飲水的方法。每天分兩次給水,間隔12小時(shí),分別給予一日水量的1/3和2/3,間斷飲盡。30min后再給炭粉液指示劑,動(dòng)物單籠喂養(yǎng),從灌墨汁開(kāi)始記錄每只動(dòng)物首粒排黑便時(shí)間和在2h內(nèi)排糞便的粒數(shù)及重量。1.3.3便時(shí)間及排氣10只小鼠隨機(jī)分為硫糖鋁組(8只)和陰性對(duì)照組(2只)。試驗(yàn)前1天記錄20只動(dòng)物首粒排黑便時(shí)間和在2h內(nèi)排便的粒數(shù)及重量。給藥方法:將硫糖鋁配制成質(zhì)量濃度為0.5g/L的溶液,每天按1mL/只灌胃小鼠1次,連續(xù)2d,第3天劑量減半,30min后再給炭粉液指示劑,動(dòng)物單籠喂養(yǎng),正常飲水和進(jìn)食,從灌墨汁開(kāi)始記錄每只動(dòng)物首粒排黑便時(shí)間和在2h內(nèi)排便的粒數(shù)及重量。1.3.4灌墨汁添加量的確定10只小鼠隨機(jī)分為禁水不禁食(8只)和陰性對(duì)照組(2只)。實(shí)驗(yàn)前1天記錄每只動(dòng)物首粒排黑便時(shí)間和在2h內(nèi)排便的粒數(shù)及重量,連續(xù)給0℃冰水混合物7天后給炭粉液指示劑,動(dòng)物單籠喂養(yǎng),正常飲水和進(jìn)食,從灌墨汁開(kāi)始記錄每只動(dòng)物首粒排黑便時(shí)間和在2h內(nèi)排便的粒數(shù)及重量。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,采用單因素方差分析,用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2小鼠肝胰腺保乳手術(shù)后兩期排放檢查如表1、圖1、圖2、圖3所示,與正常對(duì)照組比較,灌胃復(fù)方地芬諾酯、禁水不禁食、硫糖鋁及冰水法四種造模方法均可使小鼠首粒黑便排便時(shí)間顯著延長(zhǎng)、2小時(shí)內(nèi)排便粒數(shù)及排便重量顯著減少(P<0.05)。但采用復(fù)方地芬諾酯、禁水不禁食法處理的小鼠較經(jīng)口灌胃胃腸運(yùn)動(dòng)抑制劑硫糖鋁及經(jīng)口灌胃冰水誘導(dǎo)的小鼠首粒黑便排便時(shí)間顯著延長(zhǎng)、2小時(shí)內(nèi)排便粒數(shù)及排便重量亦顯著減少(P<0.01)。3小鼠臟器長(zhǎng)期排胃的一般資料,缺乏基于復(fù)方地芬諾酯的小鼠都已進(jìn)入前狀態(tài)小鼠是復(fù)制便秘模型的常用動(dòng)物,目前建立小鼠便秘模型主要依據(jù)某些中醫(yī)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法進(jìn)行,小鼠便秘模型有寒積型便秘、實(shí)熱型便秘、失水燥結(jié)型便秘、陰虛血瘀型便秘、脾虛型便秘和藥物型,每一種便秘模型均在不同程度上模擬了臨床便秘的某些特征表現(xiàn)。禁水不禁食法基于失水燥結(jié)型便秘原理,是目前便秘實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用較多的一種,制備簡(jiǎn)便,成功率高,但模型小鼠有時(shí)會(huì)出現(xiàn)無(wú)糞便現(xiàn)象。鄢順琴根據(jù)寒積中阻致腑氣不通的中醫(yī)理論,應(yīng)用冰水建立了寒積型便秘模型,該模型復(fù)制簡(jiǎn)單,但應(yīng)注意冰水的溫度等。藥物型主要應(yīng)用硫糖鋁、復(fù)方地芬諾酯及嗎啡建立小鼠便秘模型。許紹衡曾應(yīng)用硫糖鋁復(fù)制了便秘模型,該法適用于瀉下藥物藥效的研究。本研究通過(guò)四種不同的方法建立了小鼠便秘模型。復(fù)方地芬諾酯是常用的止瀉劑,主要通過(guò)直接作用于腸道平滑肌,抑制腸黏膜感受器,消除局部腸黏膜的蠕動(dòng)反射而使腸道蠕動(dòng)減慢,使腸內(nèi)容物通過(guò)延遲,致使小鼠排便減少或難排便,與便秘的臨床癥狀相似。本實(shí)驗(yàn)將小鼠禁食后,采用復(fù)方地芬諾酯一次性灌胃小鼠建立便秘模型,使小鼠首粒排便時(shí)間明顯延長(zhǎng),2h便粒數(shù)和便重量較正常小鼠顯著減少,此結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道一致。該模型屬于非特異性便秘模型,采用一次性給藥,不影響動(dòng)物的生理功能。通過(guò)禁水不禁食的方法誘導(dǎo)小鼠后,第二天即可觀察到小鼠出現(xiàn)便秘的癥狀,糞便干燥如豌豆樣圓珠狀表現(xiàn),小鼠首粒排便時(shí)間延長(zhǎng),便粒和便量顯著減少,表明限水是較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)性便秘因素,該法可用于制作小鼠便秘模型。但與復(fù)方地芬諾酯造模相比,禁水不禁食造模不如復(fù)方地芬諾酯造模操作簡(jiǎn)易和效果顯著。硫糖鋁可附著在胃腸粘膜表面,使胃腸道內(nèi)液體減少。采用硫糖鋁灌胃處理小鼠也使小鼠首粒排便時(shí)間延長(zhǎng),便粒和便量減少,但其效果明顯不如復(fù)方地芬諾酯灌胃和禁水不禁食的造模效果顯著。采用0℃~4℃的冰水造模,需要連續(xù)觀察14天,實(shí)驗(yàn)用冰水簡(jiǎn)單易得,也可使小鼠首粒排便時(shí)間延長(zhǎng),2h便粒和便量減少,但效果亦不如復(fù)方地芬諾酯灌胃和禁水不禁食造模效果明顯,且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。小鼠有隨時(shí)排便的習(xí)性,小鼠體重差別較大或食用不同飼料時(shí)糞粒形狀不同,成年小鼠正常便為長(zhǎng)粒狀(短棒狀),多單粒排出,部分糞粒可2~3粒擠壓在一起排出。籠底如有水、尿時(shí)糞便可不成形、或與墊料粘在一起,使得排便粒數(shù)和排便重量出現(xiàn)誤差,實(shí)驗(yàn)中應(yīng)盡量避免,保證結(jié)果的可靠性。食物與食量是影響大便量的基本因素之一,本實(shí)驗(yàn)采用干燥的標(biāo)準(zhǔn)飼料,但對(duì)于限水小鼠來(lái)說(shuō),干燥的飼料使其吞咽困難,表現(xiàn)在小鼠多在給水后才開(kāi)始進(jìn)食,因而食