二氫楊梅素在葡萄科的分布及應(yīng)用

二氫楊梅素在葡萄科的分布及應(yīng)用

1藤茶及持續(xù)綠茶觀二羥基楊樹(shù)林素，又稱二羥楊樹(shù)林素和蛇葡萄素，是二羥黃酮類化合物，存在于葡萄糖、楊梅、杜鵑、藤黃、赫拉和柳樹(shù)科植物中，尤其是在葡萄科的藤茶中。二氫楊梅素廣泛分布在我國(guó)云南、廣西、廣東、江西、湖南、貴州、湖北、福建等地的顯齒蛇葡萄植物莖葉中,其含量高達(dá)37.4%~38.5%。藤茶為葡萄科蛇葡萄屬中的一種野生藤本植物,學(xué)名為顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)。很久以來(lái),我國(guó)壯族和瑤族人民將其幼嫩莖葉制成保健茶,用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎、瘡癤等病癥,夏天泡茶數(shù)日不餿,有“神茶”之稱。經(jīng)化學(xué)成分分析,發(fā)現(xiàn)藤茶是一種富含黃酮類化合物的特殊植物,其中二氫楊梅素含量高達(dá)25%左右。何桂霞等的研究表明:相同季節(jié)內(nèi)葉中二氫楊梅素含量比莖中的含量高3~4倍;而不同產(chǎn)地的藤茶中二氫楊梅素含量高低有差異,其中以江華產(chǎn)藤茶中含量最高,其次為張家界,株洲產(chǎn)含量稍低。二氫楊梅素是較為特殊的一種黃酮類化合物,除具有黃酮類化合物的一般特性外,還具有解除醇中毒、預(yù)防酒精肝、脂肪肝、抑制肝細(xì)胞惡化、降低肝癌的發(fā)病率等作用。近年來(lái),藥理實(shí)驗(yàn)證明藤茶總黃酮具有鎮(zhèn)痛、止咳、廣譜抗菌、降血糖、降血脂、抗氧化等多種功效,引起人們極大的關(guān)注。2醋酸乙酯溶液二氫楊梅素[(2R,3R)-3,5,7-三羥基-2-(3,4,5-三羥基苯基)苯并二氫吡喃-4-酮],氣特殊,白色針狀結(jié)晶,mp:245~246℃,25℃水中溶解度為4%,熱水中溶解度更大;易溶于甲醇、乙醇及丙酮,極微溶于醋酸乙酯;難溶于氯仿、石油醚。林淑英等對(duì)DMY穩(wěn)定性和影響因素進(jìn)行了考察,證實(shí)二氫楊梅素溶液易發(fā)生氧化,穩(wěn)定性較差,在不超過(guò)100℃,加熱時(shí)間不超過(guò)30min以及酸性和中性條件可保持其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,而過(guò)渡態(tài)金屬離子Al3+,Fe3+,Cu2+等對(duì)二氫楊梅素的氧化起誘導(dǎo)催化作用。3dmy提取工藝研究傳統(tǒng)的二氫楊梅素提取方法有熱提取法(煎煮法、回流提取法)和浸泡提取法(滲透法、冷浸法),均存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)溶劑、效率低、重現(xiàn)性差、提取率低等不足,而且所用溶劑通常有毒,易對(duì)環(huán)境和操作人員造成危害。但陳玉瓊等研究表明采用乙醇為提取劑,以清除超氧陰離子自由基活性為跟蹤,應(yīng)用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法優(yōu)化藤茶中二氫楊梅素提取的最佳條件,提取溫度控制在65℃,浸提時(shí)間94min,料液比1:35,乙醇濃度74%,提取率達(dá)25%。鄭成等對(duì)干藤茶葉用乙醇浸泡進(jìn)行預(yù)處理,以水為溶劑提取二氫楊梅素,考察了乙醇預(yù)處理時(shí)間、茶葉與乙醇的料液比、加熱時(shí)間等因素對(duì)提取率的影響,通過(guò)單因素分析和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定了最佳提取工藝條件參數(shù)為:乙醇預(yù)處理時(shí)間為15h,茶與乙醇的料液比為1:8,加熱時(shí)間為30min,在此條件下二氫楊梅素的提取率為34.23%。微波萃取法則是利用微波能來(lái)提高萃取效率的一種新技術(shù)。不同物質(zhì)的介電常數(shù)不同,其吸收微波能的程度不同,由此產(chǎn)生的熱能及傳遞給周圍環(huán)境的熱能也不相同。它能對(duì)萃取體系中的不同組分進(jìn)行選擇性加熱,具有較好的選擇性,且微波萃取受溶劑親和力的限制較小,可供選擇的溶劑較多。微波加熱利用分子極化或離子導(dǎo)電效應(yīng)直接對(duì)物質(zhì)進(jìn)行加熱,因此熱效率高、升溫快速均勻,大大縮短了萃取時(shí)間,提高了萃取效率。楊鈴等研究表明:用正交設(shè)計(jì)法,以水為溶劑,考察了提取溫度、微波輻射時(shí)間及料液比3個(gè)因素,每個(gè)因素3個(gè)水平,選擇L9(3×3)正交設(shè)計(jì)表;結(jié)果表明,影響DMY提取率的因素為提取溫度>微波輻射時(shí)間>料液比,在提取溫度為95℃,微波輻射時(shí)間為15min,料液比為1:20時(shí)二氫楊梅素的提取率最高。采用微波萃取法大大的提高了提取效率,提取時(shí)間從直接熱提法的30min減少到了15min,而且以高效液相色譜直接測(cè)定目標(biāo)成分的含量,使得檢測(cè)更加簡(jiǎn)便、快速。3.3反應(yīng)時(shí)間和方法高效逆流色譜分離技術(shù)是運(yùn)用動(dòng)態(tài)液-液分配原理,利用螺旋管的方向性與高速行星式運(yùn)動(dòng)相結(jié)合,使兩相互不混溶的溶劑在螺旋管中實(shí)現(xiàn)高效接觸、混合、分配和傳遞,從而將具有不同分配比的樣品組分分離出來(lái)。與其他液相色譜分離技術(shù)相比,該技術(shù)不使用固相載體作為固定相。樣品在互不相溶的兩相中分配,克服了固相載體帶來(lái)的樣品吸附、損失和污染等缺點(diǎn),并能重復(fù)進(jìn)樣,應(yīng)用價(jià)值較高。逆流法提取是指提取劑從第一級(jí)加入流向最后一級(jí),而物料從最后一級(jí)加入流向第一級(jí),即兩相逆向流動(dòng)。由于DMY在熱水和冷水中的溶解度差別很大,故可選擇以水為提取劑,采用逆流法對(duì)原料中的DMY進(jìn)行提取。張友勝等用EclipseXDB-C18高效液相色譜柱(250.0mm×4.6mm,5μm),甲醇/水體積比36:64(用磷酸調(diào)pH至3.0)為流動(dòng)相,流速為1.0ml/min;進(jìn)樣量20μl,柱溫35℃,其研究表明:選用溶劑系統(tǒng)為石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水/三氯乙酸(體積比1∶3∶2∶2∶0.05),在逆流色譜儀轉(zhuǎn)速為700~800r/min,進(jìn)樣體積為2~50ml、流速1.5~2.5ml/min的條件下,在5h內(nèi)能將80%粗提物中的二氫楊梅素和楊梅素提純到99%以上,50g粗藤茶樣品連續(xù)分離其分離得率分別為85.5%和87.6%。該方法避免了分離樣品與固態(tài)載體表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而變性以及不可逆吸附等缺陷;殘留溶劑容易在較短時(shí)間內(nèi)沖凈,不會(huì)對(duì)后續(xù)分離產(chǎn)生影響,提高了分離樣品的回收率。這種方法的關(guān)鍵之處在于合適的溶劑系統(tǒng)的選擇和配比。3.4復(fù)配水提物的雜質(zhì)重結(jié)晶是利用固體混合物中目標(biāo)組分在某種溶劑中溶解度隨溫度變化的明顯差異,在較高溫度下溶解度大,降低溫度時(shí)溶解度小,從而實(shí)現(xiàn)分離提純。二氫楊梅素是極性化合物,在其水提物中,不可避免地含有單寧質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類、鹽類以及色素等雜質(zhì),這些雜質(zhì)以結(jié)合態(tài)或游離態(tài)形式與二氫楊梅素共存,需經(jīng)過(guò)多次重結(jié)晶除去雜質(zhì)。二氫楊梅素在熱水中的溶解量約為在冷水中的30倍,而且采用水加熱重結(jié)晶提純法具有操作簡(jiǎn)便、安全、廉價(jià)的特點(diǎn)。嚴(yán)贊開(kāi)等采用雙溶劑法重結(jié)晶,用38倍的無(wú)水乙醇溶解粗提物,用少量活性炭脫色,趁熱過(guò)濾后蒸出大部分乙醇,將殘留液倒入4倍的水中,陳化結(jié)晶,經(jīng)2次重結(jié)晶,二氫楊梅素的含量從50.0%提升到90.0%以上。3.5投資及回用法大孔吸附樹(shù)脂是一種不含交換基團(tuán)的、具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑,是一種親脂性物質(zhì)。通過(guò)有選擇地吸附有效成分,經(jīng)洗脫回收,除掉雜質(zhì)的一種純化精制的方法,工藝簡(jiǎn)單,操作方便,能耗少;操作條件溫和,避免了有效成分失活,而且無(wú)毒、無(wú)污染;樹(shù)脂容易回收再生,可反復(fù)利用,提取效率高。張友勝等采用“增溫溶解,保溫過(guò)柱,溫水解吸”的方法對(duì)顯齒蛇葡萄中的二氫楊梅素進(jìn)行提制研究。提純二氫楊梅素時(shí),用單位數(shù)量的D-16大孔吸附樹(shù)脂處理料液,結(jié)果表明:該方法的適宜溫度為50~70℃,最好為60℃,該方法能很好地將70%左右的二氫楊梅素提純到80%;過(guò)柱時(shí)上柱料液濃度、過(guò)柱速度以及解吸時(shí)水的流速對(duì)二氫楊梅素的提制均有影響。但該法缺點(diǎn)為樹(shù)脂用量過(guò)大,只適合于小批量不適合工業(yè)生產(chǎn)。4流動(dòng)相的選擇薄層掃描法系指用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上,對(duì)薄層色譜中有紫外或可見(jiàn)吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描,將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品的質(zhì)量檢查的方法。與高效液相色譜法相比,具有多通道效應(yīng),可同時(shí)平行分離分析多個(gè)樣品;流動(dòng)相用量少且選擇范圍寬、更換方便;固定相為一次性使用,對(duì)樣品的預(yù)處理要求不高等優(yōu)點(diǎn)。何桂霞等采用薄層掃描法測(cè)定藤茶中二氫楊梅素的含量,用定量毛細(xì)管吸取供試品溶液1μl,對(duì)照品溶液2μl,分別點(diǎn)樣于硅膠G-CMC-Na薄層板(105℃活化0.5h)上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶5)為展開(kāi)劑展開(kāi),展距15cm,用3%FeCl3乙醇溶液噴霧,顯色后,覆蓋相同大小的玻璃板,四周用透明膠紙密封。二氫楊梅素斑點(diǎn)呈紫色,測(cè)定藤茶中二氫楊梅素的含量為38.17%~38.54%,該法快速、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。4.2相對(duì)有效分離的藤茶-莖中二氫楊梅素,總評(píng)分率低,精密度高,有利于加快采收期的藤高效液相色譜分離技術(shù)是將流動(dòng)相由高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)人流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),經(jīng)過(guò)反復(fù)多次吸附-解吸的分配過(guò)程,各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出,達(dá)到組分分離的目的。高效液相色譜分離技術(shù)具有分離速度快、效率高的優(yōu)點(diǎn)。何桂霞等用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地不同采收期藤茶葉、莖中的二氫楊梅素進(jìn)行含量測(cè)定,用Nova-PakC18色譜柱(150.0mm×4.6mm,5μm),甲醇:水:磷酸(27.0∶73.0∶0.1)為流動(dòng)相,流速為1.0ml/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm,進(jìn)樣量20μl,柱溫25℃,保留時(shí)間為9.56min,線性關(guān)系良好,平均加樣回收率為99.47%,RSD為1.68%,并分離得到二氫楊梅素純品;且證實(shí)5月份藤茶中二氫楊梅素含量最高27.8%~31.2%,葉中含量高于莖中3~4倍。田森林等采用反相高效液相色譜法測(cè)定顯齒蛇葡萄植株中不同部位的二氫楊梅素的含量,用Nova-PakC18不銹鋼柱,檢測(cè)波長(zhǎng)為294nm,用甲醇-水(體積比24∶76)為流動(dòng)相,變異系數(shù)為1.125%,平均回收率為95.03%,最低檢測(cè)量為10ng。5藥理作用5.1dmy具有保護(hù)肝臟組織結(jié)構(gòu)的作用何桂霞等研究表明:DMY能抑制離體大鼠腦、心、肝勻漿及線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化并表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系;DMY對(duì)正常離體大鼠臟器組織過(guò)氧化脂質(zhì)的生成均有極顯著的抑制作用,并隨劑量增加作用增強(qiáng),而且對(duì)肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制作用最強(qiáng),這可能與肝臟具有物質(zhì)代謝等多種功能的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)(如肝臟富含線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體,分別與肝細(xì)胞進(jìn)行功能活動(dòng)的能量提供、蛋白質(zhì)合成和糖原合成密切相關(guān));線粒體腫脹程度與線粒體的生理和病理性反應(yīng)有關(guān),過(guò)度的腫脹則是線粒體損傷的表現(xiàn)。線粒體膨脹與脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)及蛋白質(zhì)組分改變,進(jìn)一步改變膜的屏障功能,引起線粒體呼吸狀態(tài)的改變,使線粒體懸液下降。DMY具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)的作用;DMY對(duì)Fe2+-Cys體系,H2O2-Fe2+體系,VitC-Fe2+體系誘導(dǎo)心、肝、腦線粒體MDA的生成均有抑制作用,且呈明顯的量效關(guān)系。5.2氫楊梅素mic的抗菌性能DMY對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、大腸埃希軍菌、產(chǎn)氣桿菌、啤酒酵母、黏紅酵母、青霉、黑曲霉、毛霉及根霉對(duì)枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、甲型溶血型鏈球菌、乙型溶血型鏈球菌、肺炎雙球菌、白色鏈球菌等16種細(xì)菌均有一定的抑制作用;尤其對(duì)革蘭陽(yáng)性、革蘭陰性球菌或桿菌作用明顯;二氫楊梅素對(duì)金黃色葡萄球菌,沙門菌,大腸埃希桿菌,產(chǎn)氣桿菌的最低抑菌濃度(MIC)均為0.625mg/ml,最低殺菌濃度(MBC)分別為0.625、0.625、1.25、1.25mg/ml;對(duì)枯草芽孢桿菌無(wú)殺菌作用;二氫楊梅素(含量90%)對(duì)牛奶酸敗混合菌群和真菌具有明顯的抑制作用,并隨著年度增加而抑菌作用增強(qiáng)。在pH7.0時(shí),純度為99.5%的二氫楊梅素對(duì)金黃色葡萄球菌,大腸埃希菌和銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株的MIC分別為0.23,1.80,0.90mg/ml,MBC分別為0.45,1.80,1.80mg/ml;對(duì)金黃色葡萄球菌,大腸埃希菌和白假絲酵母菌臨床分離株的MIC分別為0.06,1.80,0.90mg/ml;MBC分別為0.11,1.80,1.80mg/ml。從顯齒蛇葡萄中分離的DMY對(duì)金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株,乙型溶血性鏈球菌臨床分離株,肺炎鏈球菌,流感嗜血桿菌有抑菌作用,MIC均為0.63mg/ml。5.3dmy對(duì)四氯化碳和d-半乳糖所致急性肝損傷小鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響周天達(dá)等證實(shí)二氫楊梅素能拮抗去甲腎上腺素(NE)和高K+所致的兔胸主動(dòng)脈條收縮,顯示雙氫楊梅樹(shù)皮素對(duì)腸平滑肌和主動(dòng)脈條的α受體具阻斷作用;并進(jìn)一步證實(shí),二氫楊梅素對(duì)NE所引起的依賴內(nèi)Ca2+釋放的收縮有明顯的抑制作用,對(duì)NE依賴細(xì)胞外Ca2+性收縮僅在較高濃度時(shí)才顯示抑制作用,提示雙氫楊梅樹(shù)皮素對(duì)電壓依賴性鈣通道(PDC)有選擇性阻滯作用,有望開(kāi)發(fā)為抗高血壓藥。DMY能顯著地抑制CCl4、D-Gla和ANIT所致急性肝損傷小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和總膽紅素(T-BIL)的升高,減輕肝組織的病理?yè)p害程度,降低CCl4所致小鼠肝中MDA生成量,提高SOD活力,明顯抑制血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性升高。DMY0.05、0.10g/kg灌胃7d能明顯降低四氯化碳急性肝損傷小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性;明顯降D-半乳糖胺急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性和總膽紅素(T-BIL)含量;明顯降低異硫氰酸萘酯急性肝損傷小鼠血清ALT活性和T-BIL含量。DMY0.1、0.3、0.6g/kg灌胃7~8d,對(duì)四氯化碳和D-半乳糖所致急性肝損傷小鼠血清ALT和AST均有明顯的降低作用,并隨DMY劑量的增加而增強(qiáng)。含0.1%DMY飼料喂養(yǎng)大鼠,能明顯抑制D-半乳糖胺肝損傷大鼠血清ALT、AST、乳酸脫氫酶(LDH)、α-生育酚水平和谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比值的升高;DMY對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞四氯化碳中毒性損傷、D-半乳糖胺和脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有顯著的保護(hù)作用。5.5dmy的藥效學(xué)作用DMY濃度為20、40、80μmol/L時(shí),能抑制體外培養(yǎng)的小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞對(duì)重組細(xì)胞基底膜的侵襲,侵襲抑制率分別為36.1%、59.6%、79.1%;同時(shí)抑制B16瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,運(yùn)動(dòng)能力抑制率分別為51.6%、56.5%、66.8%;降低B16瘤細(xì)胞對(duì)層黏連蛋白、纖維黏連蛋白和重組細(xì)胞基底膜的黏附,降低瘤細(xì)胞黏附的效應(yīng)與DMY濃度呈正相關(guān)。DMY150、200mg/ml含藥小鼠血清對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞增殖有抑制作用,能阻斷細(xì)胞的DNA合成和復(fù)制而產(chǎn)生抑癌作用。DMY100、200、250mg/kg給每只尾靜脈注射2×105個(gè)B16黑色素瘤細(xì)胞的小鼠灌胃18d,能明顯抑制小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移灶,抑制率分別為31.0%、40.6%、61.2%。DMY濃度為0.8~500μmol/L時(shí),對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞的抑制達(dá)27.8%~78.9%。DMY10