我國(guó)三個(gè)小型豬品系脂聯(lián)素受體1基因多態(tài)性分布

我國(guó)三個(gè)小型豬品系脂聯(lián)素受體1基因多態(tài)性分布

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性物質(zhì)。具有增加脂肪酸氧化、提高葡萄糖攝取量、改善胰島素抵抗、調(diào)控血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)、抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化等作用,與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病密切相關(guān)。脂聯(lián)素通過與靶細(xì)胞膜上的G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合而起作用,受體包括2個(gè)亞型,分別為脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)和脂聯(lián)素受體2(AdipoR2),脂聯(lián)素受體1在骨骼肌中表達(dá)豐富,在調(diào)節(jié)機(jī)體胰島素敏感性及糖脂代謝中發(fā)揮重要作用。為促進(jìn)我國(guó)小型豬在糖尿病和代謝性疾病研究中的應(yīng)用,我們選取脂聯(lián)素受體1基因第5外顯子至第5內(nèi)含子之間一段長(zhǎng)為366bp的基因片段,探討其在在中國(guó)農(nóng)大小型豬、廣西巴馬小型豬和五指山小型豬中的多態(tài)性變化。1材料和方法1.1國(guó)際農(nóng)業(yè)大學(xué)提供了小型豬廣西巴馬小型豬(6頭),由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供;中國(guó)農(nóng)大小型豬(10頭),由北京市琉璃河科興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供;五指山小型豬(6頭),由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。1.2方法1.2.1提取dns取上述小型豬的血液各5mL,使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取血液基因組DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的合成參考Izabela等的研究結(jié)果,以GenBank登錄的序列為模版設(shè)計(jì)引物(GenBank登錄號(hào):AY8275691),上游引物:5’-ttcgggagaaggtggtgtttg-3’;下游引物:5’-tagcactgctcggggagaaaatac-3’送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段位于外顯子5~內(nèi)含子5,長(zhǎng)度為366bp。利用上述提取的3個(gè)品系小型豬的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系(50μL)包括:ddH2O,21μL;上下游引物,2μL;Mastermix,25μL;基因組DNA,2μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4min,94℃變性45s,59℃退火45s,72℃延伸45s,共35個(gè)循環(huán),末次循環(huán)后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后,取5μLPCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠中電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。1.2.3分離產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果及應(yīng)用一般自變量pcr產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果通過規(guī)劃u2005-20將PCR產(chǎn)物委托北京利嘉泰成科技有限公司進(jìn)行純化測(cè)序(單向測(cè)序):利用DNASTAR對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析,并根據(jù)以下兩個(gè)原則確定SNPs:①變異位點(diǎn)處雜合子的測(cè)序峰高相對(duì)純合子的而言有明顯的降低;②雜合子還會(huì)出現(xiàn)另一種測(cè)序峰。2結(jié)果2.1附加產(chǎn)品的鑒定成功擴(kuò)增出目的基因片段,長(zhǎng)度366bp,電泳結(jié)果見圖1。2.2ade檢測(cè)的細(xì)胞系統(tǒng)snps分析以中國(guó)農(nóng)大小型豬,廣西巴馬小型豬和五指山小型豬的DNA為模板,用特異性引物擴(kuò)增AdipoR-1基因外顯子5~內(nèi)含子5的部分片段(366bp),測(cè)序并利用DNASTAR軟件BLAST分析測(cè)序結(jié)果,共篩查到5個(gè)SNPs,各多態(tài)變化見表1和圖2(圖2見插Ⅶ)。3重要外顯子和內(nèi)含子檢測(cè)2003年,Yamauchi等應(yīng)用分子克隆技術(shù)確定人的脂聯(lián)素受體存在兩種異構(gòu)體,分別稱為脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)和脂聯(lián)素受體2(AdipoR2),其中脂聯(lián)素受體1位于染色體1p36,包括8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子,其中外顯子1、外顯子2的部分片段、外顯子8的部分片段是非編碼區(qū),人脂聯(lián)素受體1基因的結(jié)構(gòu)如圖3所示。2004年,Ding等克隆了豬的AdipoR1,將其定位于10p13,共編碼了375個(gè)氨基酸,與人類AdipoR1基因的同源性是97%。脂聯(lián)素受體1對(duì)球狀脂聯(lián)素的親和力較高,在肌肉組織中起到介導(dǎo)球狀脂聯(lián)素促進(jìn)脂肪酸氧化、葡萄糖攝取和增強(qiáng)胰島素敏感性的作用。Damcott等在安曼人AdipoR1基因中檢測(cè)出5個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs),發(fā)現(xiàn)AdipoR1基因的3個(gè)內(nèi)含子與安曼人2型糖尿病明顯相關(guān)。Wang等觀察了高加索、美洲和非洲的2型糖尿病患者中AdipoR1基因的8個(gè)外顯子和兩側(cè)的內(nèi)含子,確定了22個(gè)SNPs并記錄了14個(gè)序列變異,但是這些SNPs和2型糖尿病無關(guān)聯(lián),也不是高危家族非糖尿病成員胰島素敏感性和胰島素分泌的決定因素。可見,脂聯(lián)素受體1基因與2型糖尿病的相關(guān)性存在著種族的差異。Izabela等研究了豬AdipoR1的外顯子5至內(nèi)含子5之間的一段長(zhǎng)為366bp的片段,結(jié)果顯示,該片段中不存在有意義的多態(tài)性變化。本文參考Izabela的研究,在三個(gè)品系小型豬的基因組DNA中成功擴(kuò)增出目的片段,但是所得到的結(jié)果與Izabela等的研究結(jié)果完全不同。本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出了5個(gè)SNPs。SNP1:G138A,所有的樣本都出現(xiàn)該變化,并導(dǎo)致第45位氨基酸由甘氨酸(Gly)變?yōu)楣劝彼?Glu)。SNP2:G185A,所有的純合突變均發(fā)生在五指山小型豬品系中(4/6,66.67%),而所有的雜合突變則發(fā)生在中國(guó)農(nóng)大小型豬品系中(3/10,30%)。SNP3:G200A,全部發(fā)生在中國(guó)農(nóng)大小型豬品系中,且均為雜合突變(3/10,30%)。SNP4:C295T,發(fā)生在廣西巴馬小型豬品系中的突變既有雜合突變(1/6,16.67%)也有純合突變(2/6,33.33%),發(fā)生在中國(guó)農(nóng)大小型豬品系中的突變?nèi)珵殡s合突變(2/10,20%),可能是因?yàn)樾⌒拓i品系之間存在著差異,也可能是個(gè)體之間的存在著遺傳差異的原因。SNP5:T337G,只出現(xiàn)在中國(guó)農(nóng)大小型豬品系中,且為雜合突變(1/10,10%),只有一個(gè)樣本發(fā)生該點(diǎn)變化。在本實(shí)驗(yàn)中,SNP2~SNP5都位于內(nèi)含子5中,可能是不同動(dòng)物品系的遺傳差異所致,而SNP1的突變率達(dá)到100%,而且引起了氨基酸的改變,表明這一位點(diǎn)可能是我國(guó)小型