第七章 酵母基因工程2X

第七章

酵母基因工程第二節(jié)常見的酵母基因表達系統(tǒng)本章內容第一節(jié)酵母基因工程表達體系第四節(jié)酵母基因工程應用舉例---利用重組酵母

生產乙肝疫苗第三節(jié)影響外源基因表達的因素酵母菌的分類學特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔子菌綱、半知菌類，共由56個屬和500多個種組成。酵母菌是比較成熟的真核生物表達系統(tǒng)。第一節(jié)酵母基因表達體系----宿主系統(tǒng)作為宿主細胞的酵母需滿足的基本要求①安全無毒，沒有致病性。②遺傳背景清楚，容易進行遺傳操作。③外源DNA容易導入宿主細胞，轉化效率高。④培養(yǎng)條件簡單，容易進行高密度發(fā)酵。⑤有較強的蛋白質分泌能力。⑥有類似高等真核生物的蛋白質翻譯后的修飾加工能力。酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產內毒素，美國FDA認定為安全的基因工程受體系統(tǒng)酵母菌是最簡單的真核模式生物常用的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達和研究的酵母菌包括：釀酒酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵亞母屬如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）其中釀酒酵母的遺傳學和分子生物學研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達外源基因最理想。

假絲酵母屬產朊假絲酵母(Candidautilis)酵母菌表達系統(tǒng)的選擇

釀酒酵母的基因表達系統(tǒng)最為成熟，包括轉錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫釀酒酵母表達系統(tǒng)酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達。

釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達系統(tǒng)來彌補。

乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產的高效表達穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng)能穩(wěn)定遺傳40代以上。

乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達系統(tǒng)?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材

巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在甲醇培養(yǎng)基中生巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)長，甲醇可高效誘導甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達。表達系統(tǒng)優(yōu)勢：生長迅速、強啟動子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可誘導表達

由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復制型載體，所以外源基因序列一般整合入受體的染色體DNA上。其外源基因20余種具有經濟價值的重組蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達。的高效表達在很大程度上取決于整合拷貝數的多寡。目前已有“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材

多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復制序列多型漢遜酵母表達系統(tǒng)HARS已被克隆，并用于構建克隆表達載體，HARS質粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上（可連續(xù)整合100多

目前，包括乙型肝炎表面抗原在內的數種外源蛋白在該個拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構建也是采取整合的策略。系統(tǒng)中獲得成功表達。“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材釀酒酵母中的2m環(huán)狀質粒同源重組REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB環(huán)狀質粒，拷貝數達50至100個。IRs反向重復序列，600bp，重組FLP編碼產物驅動IRs的同源重組REP編碼產物控制質粒的穩(wěn)定性STBREP的結合位點接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等均與2m質粒類似。第一節(jié)酵母基因工程表達體系

--------載體“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材第一節(jié)酵母基因工程表達體系

--------載體酵母質粒載體既可以在大腸桿菌復制與擴增、又可以在酵母系統(tǒng)中復制與擴增，故此類載體又稱為穿梭載體（shuttlevector）。酵母菌-大腸桿菌穿梭表達載體是由來自酵母的部分核酸序列和細菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復制的起點序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列。酵母部分包括酵母轉化子的篩選組分，主要是與宿主互補的營養(yǎng)缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及編碼特定蛋白的基因啟動子和終止子序列。

“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材第一節(jié)

酵母基因工程表達體系

-------載體1．酵母載體的基本結構

DNA復制起始區(qū)：2μ質粒的復制起始區(qū)及酵母基因組的自主復制序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）

篩選標記：營養(yǎng)缺陷型篩選或者抗性篩選

整合介導區(qū)

有絲分裂穩(wěn)定區(qū)

表達盒：

啟動子，基因（分泌信號序列），終止子“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材2酵母載體的種類酵母整合型質粒YIp：缺乏酵母的復制起始位點，不能在酵母中自主復制，含有酵母的篩選標記ura3基因。具有整合介導區(qū)，所以，它只有整合到酵母染色體中才能穩(wěn)定(a)。酵母克隆表達載體根據其在酵母中復制形式來分類。分為下列五類：酵母載體按照用途不同可分為克隆載體和表達載體兩類“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質粒的構建

在大腸桿菌質粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標記基因，構建出來的質粒稱為YIp。目的基因表達盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材酵母附加體質粒YEp：含有釀酒酵母2m質粒DNA復制有關的序列，該載體在酵母細胞中穩(wěn)定，拷貝數可達60-100。轉化效率高（b）。

酵母復制型質粒YRp：含有來源于酵母的DNA復制起始區(qū)(ARS)，能在酵母染色體外自主復制的一種自主復制型載體，雖然其轉化效率高，在宿主的拷貝數可以達上百個（c）。

“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材

ARS為酵母菌中的自主復制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個ARS元件。

以ARS為復制子的質粒稱為YRp

上述兩類質粒在釀酒酵母中的拷貝數最高可達200個，

以2m質粒上的復制元件為復制子的質粒稱為YEp但培養(yǎng)幾代后，質粒的丟失率高達50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材2酵母載體的種類酵母著絲粒質粒YCp：含有酵母染色體著絲粒的DNA片段，這種載體在細胞分裂過程中，在母細胞和子細胞之間平均分配，表現出高度的穩(wěn)定性(d)。

CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關的序列,將CENDNA插入含ARS的質粒中，獲得的新載體稱為YCp.YCp質粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數只有1-5個。酵母人工染色體YAC：酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。YAC具有自主復制序列（ARS）、著絲粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位點以及可在細菌和酵母菌中選擇的標記基因。

YAC載體在宿主細胞中以線性雙鏈DNA存在，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點?？山邮?00-1000kb的外源DNA片段。

“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材主要結構：

①兩個可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌著絲粒序列(centromere4,CEN4)；③一個自主復制序列(ARS1)；④兩個來自嗜熱四膜蟲(Tetrahymennathermophilp)的末端重復序列(TEL)，以保持重組YAC為線狀結構；⑤在兩個末端序列中間，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便pYAC4在細菌細胞中穩(wěn)定擴增；⑥Ampr抗性及細菌質粒復制原點；⑦一個EcoRⅠ克隆位點，該位點位于酵母菌Sup4tRNA基因內。

“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材酵母菌的轉化方法用于轉化子篩選的標記基因“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材酵母菌轉化方法原生質球法：酶解酵母細胞壁，產生原生質球，原生質體在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允許DNA進入，然后使原生質球再生新的細胞壁。可以實現轉化，轉化子可達原生質體總數的1-2%。Li+鹽轉化方法：釀酒酵母的完整細胞經堿金屬離子（如Li+等）處理后，在PEG存在下和熱休克之后可高效吸收質粒DNA。醋酸鋰對釀酒酵母有效，對畢赤酵母無效，畢赤酵母轉化一般用氯化鋰有效優(yōu)點：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA（相差80倍）“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材酵母菌轉化方法電擊轉化法：原理是通過利用高壓電脈沖作用，造成細胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，形成可逆的瞬間通道，不僅有利于離子和水進入細胞，也有利于外源DNA等大分子進入優(yōu)點：不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件；適用范圍廣；轉化率高（達105/mgDNA）。PEG轉化法：PEG1000“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材酵母細胞轉化特點單、雙鏈DNA均可轉化，但單鏈的轉化率是雙鏈的10-30倍單鏈質粒進入細胞后，能轉化為雙鏈并復制（含有復制子）或同源整合入染色體（不含復制子）克隆在YIp上的外源基因，會發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉化子總數的50-80%“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材用于轉化子篩選的標記基因

營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA等

但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難營養(yǎng)缺陷型的互補基因“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材用于轉化子篩選的標記基因其編碼產物只要是毒性物質的抗性蛋白顯性標記基因aph

氨基糖苷轉移酶抗G418

cat

氯霉素乙酰轉移酶抗氯霉素dhfr

二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

銅離子螯合物耐受銅離子suc2

蔗糖轉化酶耐受高濃度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑標記基因編碼產物遺傳表型“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材第二節(jié)常見的酵母基因表達系統(tǒng)一、釀酒酵母表達系統(tǒng)1，啟動子

組成型表達的啟動子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）啟動子、甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH或GAPl）啟動子可控性啟動子：半乳糖啟動子（GAL）、酸性磷酸酶啟動子（PHO）、乙醇脫氫酶（ADH2）啟動子、Cu2+螯合蛋白啟動子（CUPI）以及交配a型阻遏系統(tǒng)（MATa/a）

“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材酵母菌啟動子的可控性pho4TS-PHO5啟動子：釀酒酵母PHO5啟動子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開PHO4基因編碼產物是PHO5啟動子的正調控因子因此，裝在pho4TS-PHO5啟動子下游的外源基因在35℃時關閉23℃誘導表達溫度控制型啟動子PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產物在35℃時失活“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材酵母菌啟動子的可控性a–a

型啟動子釀酒酵母有a和a兩種單倍體，分別由MATa和MATa兩個等位基因決定。a1因子決定a細胞特征表達a2因子阻遏a細胞特征表達a1-a2阻遏a細胞特征表達編碼a2因子的基因突變型hmla2-102能產生a2變體，它能滅活a1，同時阻遏a型溫度控制型啟動子a型啟動子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型啟動子

受體細胞基因組

重組質粒a型啟動子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型啟動子a2a125℃35℃（–）“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材酵母菌啟動子的可控性釀酒酵母超誘導型啟動子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80基因基底水平表達GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導時，GAL4高效表達，GAL1、GAL1、GAL10超高效表達GAL10Promoter的半乳糖利用酶系由GAL1

GAL7和

GAL10基因編碼“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材雜合啟動子：將釀酒酵母的乙醇脫氫酶Ⅱ基因（ADH2）所屬啟動子的上游調控區(qū)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）所屬啟動子的下游基本區(qū)重組在一起，構建出ADH2-GADPH型雜合啟動子“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材釀酒酵母表達載體目前已建立的釀酒酵母表達載體有（1）酵母附加體質粒(YEp)（見右圖）；（2）酵母復制型質粒(YRp)；（3）酵母著絲粒質粒(YCp)；（4）酵母整合型質粒(YIp)；（5）酵母人工染色體(YAC)。前三類統(tǒng)稱為游離自主復制型質粒載體。含有來自酵母基因組的復制起始區(qū)ARS或者酵母天然質粒2m復制起點序列，能夠自主復制，通常為多拷貝數“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材釀酒酵母宿主

有些蛋白酶缺陷有利于重組異源蛋白的穩(wěn)定表達。如pep4-3突變株中蛋白酶的活性顯著降低，對外源基因表達產物的降解作用較小。

“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌能導致釀酒酵母中重組蛋白產量提高或質量改善的突變類型ssc1

改善重組蛋白分泌鈣離子依賴型的ATP酶ssc2

提高重組蛋白表達轉錄后加工rgr1

提高重組蛋白表達轉錄水平ose1

提高重組蛋白表達轉錄水平ssc11

改善重組蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提高重組蛋白表達轉錄水平突變類型生物效應作用位點“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材釀酒酵母宿主

為了減少目的蛋白的過度糖基化，目前已從野生型的釀酒酵母中分離出許多類型的糖基化途徑突變株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突變株、天門冬酰胺側鏈糖基化缺陷的alg突變株以及外側糖鏈缺陷型的och突變株等。在這些突變株中，具有重要實用價值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因為它們不能在異源蛋白的天門冬酰胺側鏈上延長甘露多聚糖長鏈。

“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材抑制超糖基化作用的突變宿主菌能抑制超糖基化的突變類型mnn

甘露糖生物合成缺陷型alg天冬酰胺側鏈糖基化缺陷型och外側糖鏈添加缺陷型突變類型生物效應

許多真核生物的蛋白質在其天冬酰胺側鏈上接有寡糖基團，它們常常影響蛋白質的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側糖鏈兩部分組成。

酵母菌普遍擁有蛋白質的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素介導的蛋白質降解作用蛋白酶體LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因酵母菌有四個泛素編碼基因：UBI1

編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對數生長期表達穩(wěn)定期關閉UBI2

編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對數生長期表達穩(wěn)定期關閉UBI3

編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）對數生長期表達穩(wěn)定期關閉UBI4

編碼泛素五聚體對數生長期關閉穩(wěn)定期表達酵母菌有七個泛素連接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素降解途徑衰減的釀酒酵母釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表達，UBI4-突變株能UBI4缺陷型：外源基因表達理想的受體正常生長，但細胞內游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，UBA1缺陷型：減少蛋白降解UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導的蛋白降解Ubc4-ubc5雙突變型：減少蛋白降解七個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材二、畢赤酵母（Pichiapastoris）表達系統(tǒng)

1.啟動子

（1）AOX1和AOX2啟動子（2）三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldeyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）啟動子（3）甲醛脫氫酶（formaldehydedehydrogenase,FLD）啟動子“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材2畢赤酵母表達載體類型胞內表達載體pPICZA,B,C分泌型表達載體pPICZaA,B,C“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材畢赤酵母表達載體上無酵母復制起點，它是靠AOX1或HIS4基因的位置同源重組整合入酵母染色體DNA中，并隨酵母的生長傳代穩(wěn)定地存在。整合的方式可以是單交換插入，亦可雙交換插入，一般來說前一種方式更容易發(fā)生。3載體的整合方式依據具體整合位點及相應產生的轉化子的類型可分為三種情況：“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材5’AOX1和3’AOX1與染色體發(fā)生同源重組，使受體染色體帶有一個拷貝的外源基因。這種情況有功能的AOX1基因被替換而丟失后，只能利用弱的AOX2基因啟動合成AOX，就產生His+MutS表型(methanolutilizationslow)，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長緩慢。此時，甲醇利用率很低，但它表達外源基因的效率高染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發(fā)生置換，使得一個或多個表達單位插入在his4位點，產生的表型也是His+Mut+染色體AOX1區(qū)與載體質粒的AOX1區(qū)發(fā)生單位點互交換，外源基因的表達單位插入在基因區(qū)AOX1基因的上游或下游，這一過程可重復發(fā)生，使得更多拷貝的表達單位插入基因組中。這種情況AOX1基因仍然有活性，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長正常，產生的表型是His+Mut+。

“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材在畢赤酵母中有3種方法可以得到多拷貝表達菌株。第一種方法直接構建含高拷貝外源基因的表達載體，在體外利用同尾酶向載體中多次插入首尾相連的表達盒。此法的優(yōu)點是一次整合，即可有多個表達盒插入染色體。但體外基因操作較繁瑣。第二種方法是利用含有kanr基因的載體。細菌來源的卡那霉素抗性基因在酵母中賦予宿主抵抗真核抗生素G418。G418的抗性水平大致與載體的拷貝數相關。提高抗生素G418的濃度可以得到含高拷貝表達載體的轉化菌株。第三種方法是用含有Zeocin抗性標記基因Shble的載體來構建多拷貝菌株。來源于細菌的Shble在酵母中賦予宿主對抗生素zeocin的抵抗能力，通過提高zeocin濃度可篩選出含高拷貝表達載體的轉化菌株。然而與G418篩選相似，大多數能抵抗高水平zeocin的轉化子并不含有多載體拷貝。

“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材4宿主常用的畢赤酵母受體菌株有：組氨酸缺陷型GSl15和SMD1168，腺嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16，其中SMD1168為蛋白酶缺陷型，以其作為宿主表達蛋白可以降低表達產物的降解。這些表達宿主都是由野生品系NRRL-Y11430衍生來的。最常用的受體菌是Cregg在1985年建立的GS115，它含有一個組氨醇脫氫酶缺陷型基因His4，可接受含His4的載體而具有His+表型來篩選轉化子。根據對甲醇利用的情況，畢赤酵母可劃分為三種表型。菌株含有AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長速率與野生型類似，稱為甲醇利用正表型（Mut+），如GS115；當AOX1被其他基因取代，則需依賴AOX2，但其甲醛代謝速度慢，稱為甲醇利用慢表型（Muts），如KM71。當AOX基因全部缺失，則不能利用甲醇，稱為甲醇利用負表型（Mut-），如MC100-3。后兩者胞內表達外源蛋白質有時優(yōu)于野生株，且需甲醇較少。此外為增加分泌蛋白質穩(wěn)定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4,prb1)?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材第三節(jié)影響外源基因表達的因素外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后mRNA的二級結構，提高外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對密碼子的偏愛性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個密碼子編碼的一、轉錄水平控制二、表達載體的拷貝數和穩(wěn)定性三、其他因素“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材優(yōu)化工程菌發(fā)酵工藝避免表達產物在細胞內的降解，選擇或改造宿主，如：采用二倍體宿主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為宿主第三節(jié)影響外源基因表達的因素“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材

利用重組酵母生產乙肝疫苗第四節(jié)酵母基因工程應用實例

由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴重的傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當一部分人可能轉化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產對預防病毒感染具有重大的社會效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產乙型疫苗為其廣泛應用提供了可靠的保證?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材

利用重組酵母生產乙肝疫苗產乙肝表面抗原的重組釀酒酵母乙型肝炎病毒的結構與性質產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材乙型肝炎病毒的結構與性質

乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，病毒顆粒呈乙型肝炎病毒的結構球面狀，直徑為42nm，基因組僅為3.2kb。病毒顆粒的主要結構蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內的蛋白包括核心抗原（HBcAg）、

此外，被乙肝病毒感染的人肝臟還能合成并釋放大量的22病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是各種未裝配的包裝蛋白的1000倍。包裝蛋白共有三種轉膜糖蛋白：S、M、L多肽?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材乙型肝炎病毒的結構與性質乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因ATGATGATGTAA108aa55aa226aapreS1preS2SS多肽226aaM多肽281aaL多肽399aa“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材乙型肝炎病毒的結構與性質

乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細胞膜上提取出來的。這種來源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產業(yè)化?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材產乙肝表面抗原的重組釀酒酵母

20世紀80年代開始選擇釀酒酵母表達重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動子控制下，轉化子能表達出具有免疫活性的重組蛋白，它在細胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結構和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。

目前，由釀酒酵母生產的重組HBsAg顆粒的最終產量可達細胞總蛋白量的1%-2%。

進一步的研究表明，M多肽和L多肽對S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構成的復合型乙肝疫苗還可以誘導那些對S抗原缺乏響應的人群的免疫反應。“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母整合型重組巴斯德畢赤酵母的構建PARS2BglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1BglIIpBSAG15111kbBglII5’AOX1HBsAgPHIS43’AOX1his+的轉化子重組