基因工程課件：第三章 大腸桿菌基因工程

第三章大腸桿菌基因工程Escherichiacoli

（SEM，×14000）

四、工程菌分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化三、工程菌構(gòu)建策略二、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)原理一、大腸桿菌表達(dá)（生產(chǎn)）系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)五、利用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白案例第三章大腸桿菌基因工程原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的差別因?yàn)榭蓯鄱鴲勰恪獌?yōu)點(diǎn)遺傳背景清楚，便于基因操作表達(dá)水平高，遺傳較穩(wěn)定

優(yōu)良的工業(yè)性能：繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、被美國FDA認(rèn)定為安全的重組藥物生產(chǎn)系統(tǒng)一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)你有不足，但你仍是最愛——缺點(diǎn)胞內(nèi)缺乏高效的表達(dá)產(chǎn)物折疊機(jī)制（形成包涵體），分泌機(jī)制不完善缺乏翻譯后修飾加工系統(tǒng)（不能表達(dá)糖基化蛋白、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白等）細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)二、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)原理1、表達(dá)載體的基本元件2、啟動(dòng)子與外源基因表達(dá)3、其它元件與外源基因表達(dá)

1、表達(dá)載體的基本元件A、目的基因：編碼外源蛋白的結(jié)構(gòu)基因B、轉(zhuǎn)錄元件：啟動(dòng)子、終止子C、翻譯元件：核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)D、克隆元件：克隆位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因E、翻譯后元件（非必須）：信號肽、融合肽2、啟動(dòng)子與外源基因表達(dá)*啟動(dòng)子是最強(qiáng)的表達(dá)調(diào)控元件，啟動(dòng)子的強(qiáng)弱對表達(dá)水平有決定性影響。（mRNA生成速率）*-10區(qū)和-35區(qū)六聚體盒子及間隔長度*啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)距離

大腸桿菌一般是6-9個(gè)堿基啟動(dòng)子*據(jù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式分

組成型和誘導(dǎo)型2類

*大腸桿菌天然啟動(dòng)子（表達(dá)載體應(yīng)用）

Plac、Ptrp、PL、PrecA（乳糖操縱子、色氨酸操縱子、噬菌體左早期操縱子、RecA）雙Plac=2.4Plac啟動(dòng)子保守序列-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動(dòng)子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11PlacPtac=3Ptrp=11PlacPtrp的-35區(qū)與Plac的-10區(qū)組成型與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子*無需誘導(dǎo)*整個(gè)生長過程一直不停地表達(dá)目的蛋白*一般采用基礎(chǔ)代謝關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子*不適合表達(dá)一些對宿主細(xì)菌生長有害的蛋白產(chǎn)物*表達(dá)量通常不高：過量或者有害表達(dá)影響細(xì)菌生長組成型表達(dá)系統(tǒng)組成型與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子*只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物（防質(zhì)粒丟失）*使生長相與表達(dá)相分開，避免表達(dá)與生長爭營養(yǎng)和對菌體的毒害*可減少菌體蛋白酶對目標(biāo)產(chǎn)物的降解*特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)*啟動(dòng)子是組成型的，但是啟動(dòng)子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)P乳糖啟動(dòng)子PlacOPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高lacI負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控β半乳糖苷酶β半乳糖苷透過酶β半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶P乳糖啟動(dòng)子PlacOPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控lacI負(fù)調(diào)控P乳糖啟動(dòng)子PlacOPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基高水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控lacI負(fù)調(diào)控P乳糖啟動(dòng)子PlacO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高轉(zhuǎn)錄受CAP正調(diào)控和lacI負(fù)調(diào)控lacI負(fù)調(diào)控PlacCAP正調(diào)控OPlacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝野生型的Plac上游附近擁有代謝激活因子（CAP）結(jié)合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP基底水平轉(zhuǎn)錄結(jié)合啟動(dòng)子控制區(qū)，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAMP減少，也能阻遏Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。因此，基因工程中使用的乳糖啟動(dòng)子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉(zhuǎn)錄突變型乳糖啟動(dòng)子PlacUV5受lacI阻遏蛋白調(diào)控雜合型啟動(dòng)子PtacPtac

=

Ptrp

的-35區(qū)+

Plac的-10區(qū)Ptac

=

3

Ptrp

=

11

Plac（TTGACA）（TATAAT）*基于lacI調(diào)節(jié)模式的優(yōu)點(diǎn)：可采用安慰誘導(dǎo)劑IPTG，不降解，穩(wěn)定，最常用。*基于lacI調(diào)節(jié)模式的缺點(diǎn)：在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達(dá)量不高，無法應(yīng)付多拷貝質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達(dá)。*改進(jìn)措施：

A、采用能過量表達(dá)lacI阻遏蛋白的lacIq

突變菌株

B、在

載體上引入lacIq

基因基于lacI阻遏蛋白調(diào)控模式的改進(jìn)l噬菌體啟動(dòng)子PL/

PR受CI阻遏蛋白阻遏常采用溫度敏感型突變cI857cI857阻遏蛋在42℃時(shí)失活脫落，PL便可介導(dǎo)目的基因的表達(dá)。但在大型細(xì)菌培養(yǎng)罐中迅速升溫非常困難，因此常使用一個(gè)雙質(zhì)?？刂葡到y(tǒng)，用色氨酸間接控制目的基因表達(dá)。PtrpABcI857PL目的基因阻遏作用PtrpABPL表達(dá)色氨酸T7啟動(dòng)子——異源啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子——最成功的啟動(dòng)子

*強(qiáng)大的T7啟動(dòng)子完全專一受控于T7RNA聚合酶，*T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶的快5倍*由于大腸桿菌本身不含T7RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌。*以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。T7啟動(dòng)子調(diào)控模式

IPTG誘導(dǎo)T7RNA聚合酶表達(dá)噬菌體DE3（lambda噬菌體的衍生株）含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動(dòng)子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好的表達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac一樣都是IPTG誘導(dǎo)。T7啟動(dòng)子調(diào)控模式

2.熱誘導(dǎo)T7RNA聚合酶用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，用λCE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞——CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動(dòng)子控制T7RNA聚合酶的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7RNA聚合酶的合成。T7啟動(dòng)子調(diào)控模式

3.溶氧誘導(dǎo)T7RNA聚合酶通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提供T7RNA聚合酶。用受溶氧濃度控制的啟動(dòng)子調(diào)控T7RNA聚合酶合成，以適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制。3.其它元件與外源基因表達(dá)

1）終止子2）核糖體結(jié)合位點(diǎn)3）質(zhì)?？截悢?shù)（復(fù)制子）4）外源基因終止子外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；干擾質(zhì)粒的復(fù)制及抗性，導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗；不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象：

RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物。核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）:

mRNA5‘端序列,包括SD、起始密碼子、SD與起始密碼子間的序列、起始密碼子下游序列。

商品化大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒均含有與啟動(dòng)子來源相同的RBS，序列和間隔是最佳的核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列（Shine-Dalgarno）：

位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列（5’UAAGGAGG3’），它通過識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯。核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列與起始密碼子之間的距離的影響：

SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列與起始密碼子之間的序列的影響：

SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個(gè)堿基成份對翻譯起始也有影響，對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個(gè)位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低20倍核糖體結(jié)合位點(diǎn)翻譯起始密碼子及其下游序列大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子。起始效率差異：GUG為AUG的50%而UUG只及AUG的25%。從AUG開始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。lacI編碼區(qū)GTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGA密碼子宿主對密碼子的偏愛性不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因滿足宿主對密碼子偏愛性偏愛性的策略密碼子按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計(jì)更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡并密碼子。外源基因全合成（最常用）質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒拷貝數(shù)對細(xì)菌生長代謝的影響（20000核糖體單位，600種mRNA1500分子）目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子pCP3PLMCSoriApr在28℃時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為60在42℃時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至300-600在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的CI基因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)?？截悢?shù)和基因的表達(dá)三、工程菌構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)寡聚型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體（InclusionBodies）：

高效表達(dá)型工程菌大量合成異源蛋白質(zhì)時(shí)所形成的水不溶性積聚物。性質(zhì)：致密（密度大于細(xì)胞碎片和所有細(xì)胞器）、還含有宿主蛋白和少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。裸露或被膜包裹。

包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體形成原因：

胞內(nèi)新合成肽的折疊效率跟不上合成速度。表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)形式：

部分屬于折疊過程中的產(chǎn)物；部分為無序卷曲與聚集，分子內(nèi)和分子間存在大量錯(cuò)配二硫鍵。包涵體型異源蛋白的表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)能簡化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅包涵體型異源蛋白的表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)停话悴怀^30%包涵體型異源蛋白的表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此，以包涵體形式表達(dá)目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達(dá)的載體（如pET)。包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的溶解與變性：包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯(cuò)配的二硫鍵和次級鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括：表面活性劑SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化促溶劑鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極端pH廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)是：通過次級鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性將多肽鏈中被拆開的游離巰基重新折疊包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作包涵體復(fù)性操作的方法包括：分段稀釋法，逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生一步稀釋法，蛋白復(fù)性與濃度無關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大試劑添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法，氨基檸檬酸酐?；?，蛋白帶負(fù)電，抑制集聚產(chǎn)物隔離法，將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侶法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號肽(如ompE)序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件分泌型異源蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對蛋白酶不敏感

以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)定性高重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)

N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸

桿菌的信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍3、融合型異源蛋白的表達(dá)*將外源基因與標(biāo)簽（Tag)拼接在一起作為一個(gè)ORF進(jìn)行表達(dá)*Tag可置于目的蛋白的N端或C端*通過在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白融合型異源蛋白的表達(dá)啟動(dòng)子Tag接頭目的基因ATG/MetStopCNBr蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)表達(dá)親和層析酶解回收ORF以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高

受體菌自身蛋白目的蛋白易于分離

利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)目的蛋白表達(dá)率高

與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件

胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段

行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白目的蛋白溶解性好

由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在缺點(diǎn)：融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲目的蛋白。融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：Tag可滿足親和層析分離表達(dá)產(chǎn)物的需要兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架小分子肽與大分子Tag融合，反之則反用于融合蛋白構(gòu)建的Tag谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）維持良好空間構(gòu)象硫氧化還原蛋白（TrxA）維持良好空間構(gòu)象pTrxFus麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）促進(jìn)分泌外膜蛋白（OmpF）促進(jìn)分泌b-半乳糖苷酶（LacZ）免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）維持良好空間構(gòu)象His6易于親和層析、不影響目的蛋白結(jié)構(gòu)、無免疫原性Strep.Tag(8)-streptavidin高親和力，溫和洗脫，效果好目的蛋白的回收融合蛋白中Tag的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種：化學(xué)斷裂法酶促裂解法溴化氰（CNBr）：專一切除甲硫氨酸或其后多肽。優(yōu)點(diǎn)：回收率高（可達(dá)到85%以上），專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。缺點(diǎn)：如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法化學(xué)斷裂法酶促裂解法單殘基位點(diǎn)：蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假單孢菌蛋白酶Lys-C豬胰蛋白酶Arg-CLys-C幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當(dāng)高的ArgCNNCTag目的蛋白酶促裂解法多殘基位點(diǎn)(凝血因子Xa)加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)PinpointXatac生物素結(jié)合肽編碼序列Xa因子識(shí)別位點(diǎn)編碼序列SP6T7AproriMCSATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-1IleGluGlyArgGluATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaINotIXa因子切割位點(diǎn)PreSicissionProteaseTag(5℃消化）*Intein:酵母來源的蛋白質(zhì)剪接元件，類似于基因組中的內(nèi)含子Intron在RNA的剪接中所起的重要作用，

intein在較低的溫度和還原條件下發(fā)生自身介導(dǎo)的N端裂解，可以釋放出與之相連的目的蛋白。*IMPACT：枯草桿菌的幾丁質(zhì)結(jié)合域（5KD，用于親和純化）和intein組成一個(gè)雙效的fusiontag，再與克隆到多克隆位點(diǎn)的目的基因融合表達(dá)。*融合表達(dá)產(chǎn)物在掛上親和層析柱后只需要在低溫（4度）條件下用含DTT，或者巰基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脫，即可將目的蛋白洗脫基于蛋白質(zhì)剪接元件Intein的IMPACT系統(tǒng)寡聚型異源蛋白的表達(dá)從理論上講，外源基因的表達(dá)水平與受體細(xì)胞中可轉(zhuǎn)錄基因的拷貝數(shù)（即基因劑量）呈正相關(guān)。然而重組質(zhì)粒除了含有外源基因外，還攜帶其它的可轉(zhuǎn)錄基因，如作為篩選標(biāo)記的抗生素抗性基因等。隨著重組質(zhì)粒拷貝數(shù)的不斷增加，受體細(xì)胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細(xì)胞的正常生長代謝卻因能量不濟(jì)受到影響，因此通過增加質(zhì)?？截悢?shù)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。另一種通過增加外源基因劑量而提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的有效方法是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體，即將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達(dá)的策略寡聚型異源蛋白的表達(dá)以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白高效表達(dá)在不提高質(zhì)粒拷貝數(shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽在一定程度上改善表達(dá)量目的產(chǎn)物回收困難短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌細(xì)胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高寡聚短肽需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性寡聚型異源蛋白的表達(dá)寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本戰(zhàn)略：寡聚型異源蛋白的表達(dá)寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建構(gòu)建舉例：PSDT1T2EcoRIBamHIAATTCAGATCTGTCTAGAGCCTAGEcoRIBglIIBamHIEcoRIBamHIBglIIGATCTAGCCTAGEcoRIBamHIBglIIEcoRIBamHIBglIIEcoRI+BamHIBglII+BamHIBamHI整合型異源蛋白的表達(dá)防止丟失以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的基因穩(wěn)定表達(dá)整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù)目的基因表達(dá)率低單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制，此時(shí)可通過強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，這對以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理在很多原核細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組，其頻率與細(xì)菌種類、兩個(gè)同源區(qū)之間的距離同源區(qū)的長度、同源程度密切相關(guān)。一般地說，距離越遠(yuǎn)、長度越長、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個(gè)斷裂位點(diǎn)，而后者涉及兩個(gè)斷裂位點(diǎn)同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記基因整合位點(diǎn)染色體DNA整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的基本原理同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記基因交換區(qū)域染色體DNAori標(biāo)記基因+蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所有的極性氨基酸中，天門冬氨酸（Asp）的存在對提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的效應(yīng)最顯著，而且Asp殘基離C末端越近，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越大。更為重要的是，在多種結(jié)構(gòu)和功能相互獨(dú)立的蛋白質(zhì)C末端引入Asp殘基，都能顯著地延長這些蛋白質(zhì)的半衰期，因此具有普遍意義?？沟鞍酌傅闹亟M異源蛋白序列的設(shè)計(jì)多肽鏈C末端氨基酸序列對穩(wěn)定性的影響：蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，如果多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，則蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性顯著改善。相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細(xì)胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞內(nèi)蛋白酶的超敏感區(qū)?？沟鞍酌傅闹亟M異源蛋白序列的設(shè)計(jì)多肽鏈N末端氨基酸序列對穩(wěn)定性的影響：（蛋白酶缺陷受體菌）D基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策6大腸桿菌基因工程基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長代謝產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動(dòng)降解程序重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配這是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制重組質(zhì)粒的逃逸率一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比稱為當(dāng)含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長時(shí)，培養(yǎng)系統(tǒng)中稱為重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率。重組質(zhì)粒逃逸的原因有：高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏（分泌至胞外）受體細(xì)胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配，細(xì)胞所含重組質(zhì)?？截悢?shù)的差異隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而加劇改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略改進(jìn)載體受體系統(tǒng)以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括：將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達(dá)型載體中，其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細(xì)胞正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn)，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細(xì)胞的致死性基因安裝在載體上，同時(shí)構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的ssb基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高養(yǎng)組份改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略控制目的基因的過量表達(dá)使用可控型啟動(dòng)子控制目的基因的定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時(shí)增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素6大腸桿菌基因工程胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成人胰島素的生產(chǎn)方法重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)的特異性肽酶NC信號肽B肽C肽A肽信號肽酶胰島素原單鏈多肽活性胰島素人胰島素的生產(chǎn)方法直接提取法制人胰島素迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，由于原料供應(yīng)的限制，其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增多的糖尿病人的臨床需求。人胰島素的生產(chǎn)方法化學(xué)合成法制人胰島素根據(jù)人胰島素A鏈和B鏈的序列，由單個(gè)氨基酸從頭合成。這條化學(xué)全合成的路線從技術(shù)上來說是能夠做到的，但其生產(chǎn)成本奇高，從而也限制了產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用。人胰島素的生產(chǎn)方法基因工程法制人胰島素1982年，美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。1987年，Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點(diǎn)，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分