大劑量激素對(duì)木豆葉對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

大劑量激素對(duì)木豆葉對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

激素的使用是非創(chuàng)傷性骨腫壞死的常見(jiàn)原因。它是我國(guó)飲酒的第二大病因。目前，對(duì)其起源機(jī)制的理解尚不統(tǒng)一。有許多假設(shè)：脂肪栓塞、骨細(xì)胞脂肪退化等。一些研究表明，高劑量激素可以誘導(dǎo)msec被誘導(dǎo)變成脂肪細(xì)胞，這會(huì)導(dǎo)致骨細(xì)胞分離不足和骨細(xì)胞壞死。木豆葉是豆科植物木豆的干燥葉片,有活血化瘀、消腫止痛、補(bǔ)腎壯骨、去腐生肌之功效,實(shí)驗(yàn)證實(shí)木豆葉能有效治療股骨頭壞死,有增強(qiáng)骨壞死修復(fù)、促進(jìn)血管生成及延緩細(xì)胞凋亡的作用。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)木豆葉成分的生脈成骨片對(duì)激素誘導(dǎo)下MSCs成脂分化有拮抗作用,但其具體機(jī)制尚不明確。本研究擬通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,探尋激素誘導(dǎo)下的MSCs以及誘導(dǎo)過(guò)程中加入木豆葉含藥血清后MSCs蛋白質(zhì)表達(dá)的變化,闡釋激素性股骨頭壞死的致病機(jī)理及木豆葉防治股骨頭壞死的機(jī)理。1材料和方法1.1動(dòng)物SD大鼠20只,SPF級(jí),雌性,體質(zhì)量160~180g,南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):4402101564。1.2碘乙酰胺iaa、四甲基乙二胺tegm、硝酸銀、siga袁氏生脈成骨片,廣州市康元藥業(yè)有限公司,批號(hào):121003,成分為木豆葉;甲強(qiáng)龍,輝瑞公司,批號(hào):Z01579;L-DMEM培養(yǎng)基、南美胎牛血清、胰酶,GIBCO公司;碘乙酰胺(IAA)、IPG膠條、pharmalyteTM3-10forIEF,GE公司;四甲基乙二胺(TEMED)、硝酸銀,Sigma公司;二硫蘇糖醇(DTT),Biosharp公司;30%甲叉雙丙烯酰銨溶液(Bis)、過(guò)硫酸銨(APS)、蛋白定量試劑盒,Bio-rad公司;五水合硫代硫酸鈉、冰醋酸、甲醛、鹽酸,廣州化學(xué)試劑廠;甲醇,廣東光華科技股份有限公司;礦物油,MPBiomedicals公司;甘油、尿素、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、瓊脂糖,上海生工生物公司。1.3分析軟件及測(cè)試EttanTMIPGphorIITM等電聚焦儀、EttanTMDALTsix垂直電泳儀、掃描儀及ImageMasterTM2DPlatinum6.0分析軟件,GE公司;UVmini-1240紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),Shimadzu公司;Centrifuge5804R離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;AutoflexspeedTMMALDI-TOF質(zhì)譜儀,BrukerDalton公司。1.4方法1.4.1灌胃時(shí)引物過(guò)胃法SD大鼠隨機(jī)分為中藥組和正常對(duì)照組,中藥組灌胃給予生脈成骨片混懸液(0.6g·kg-1),每日1次,連續(xù)灌胃1周,最后1次給藥后2h經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,室溫靜置2h后置2500r·min-1離心10min,收集上清液,56℃水浴滅活30min,過(guò)濾后置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。正常?duì)照組采用等量生理鹽水灌胃,采血及保存方法與中藥組相同。1.4.2單核細(xì)胞層的制備選擇髖骨性關(guān)節(jié)炎行人工關(guān)節(jié)置換患者,術(shù)中使用含肝素的注射器吸取股骨近端骨髓組織約10mL,將細(xì)胞懸液貼壁緩慢注入到預(yù)置有等體積密度為1.077kg·L-1的淋巴細(xì)胞分離液的試管內(nèi),以2500r·min-1離心20min,吸取中間的白色云霧狀單核細(xì)胞層,PBS漂洗,1500r·min-1離心10min,棄上清,加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液10mL并接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3d換液1次。待細(xì)胞融合至80%后用胰蛋白酶消化,以1∶2傳代培養(yǎng)。1.4.3干預(yù)msc1.4.4超聲破乳處理吸出細(xì)胞加入PBS清洗3次,去除PBS后加入裂解液,將細(xì)胞團(tuán)塊吹散后轉(zhuǎn)移到EP管中超聲處理,12000r·min-1離心20min,收集上清液分裝至EP管中,-20℃丙酮沉淀過(guò)夜。過(guò)夜后12000r·min-1離心20min,倒去上清液后自然干燥,蛋白質(zhì)團(tuán)塊-80℃保存?zhèn)溆谩?.4.5ipg膠條電泳取出蛋白質(zhì)團(tuán)塊加再水化液200μL溶解,Bradford法測(cè)濃度,蛋白質(zhì)上樣量為120μg,尿素水化液加至450μL泡脹過(guò)夜后第一向等電聚焦,等電聚焦完成后分別置于1%DTT和2.5%碘乙酰胺的平衡緩沖液中平衡15min,再將IPG膠條置于玻璃板間的凝膠面上,瓊脂糖密封液封閉,進(jìn)行第二向電泳,待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)膠底時(shí)關(guān)閉電泳儀。1.4.6硫代硫酸鈉敏化染色將凝膠置于固定液(40%甲醇,10%醋酸)中搖床固定30min。水洗5min×6次,0.02%硫代硫酸鈉敏化1min。水洗20s×3次。置于染色液(0.2%硝酸銀,0.02%甲醛)中20min,水洗20s×3次。置于顯色液(3%碳酸鈉,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸鈉)中顯示到理想色度,5%醋酸終止后置于蒸餾水中。1.4.7圖像分析方法掃描儀掃描保存圖像,見(jiàn)圖1。使用ImageMaster2DPlatinum6.0圖像分析軟件,搜索差異點(diǎn),用針在凝膠相應(yīng)點(diǎn)的邊緣劃圈,將膠粒挑到EP管中進(jìn)行酶切、肽段抽提、點(diǎn)靶及質(zhì)譜分析,利用flexAnalysis軟件過(guò)濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰。利用BioTools軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)。2結(jié)果2.1木豆葉含藥血清中mscs蛋白點(diǎn)的變化見(jiàn)圖2。與正常對(duì)照組比較,模型組MSCs有38個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生顯著變化,其中上調(diào)29個(gè),下調(diào)9個(gè)。與模型組比較,木豆葉含藥血清組MSCs有28個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生變化,其中上調(diào)20個(gè),下調(diào)8個(gè)。按模型組下調(diào)、模型組上調(diào),木豆葉含藥血清組下調(diào)和上調(diào)的順序,將蛋白分為A組、B組、C組和D組并按順序用阿拉伯?dāng)?shù)字編號(hào)。2.2蛋白點(diǎn)的搜索見(jiàn)圖3。將有顯著性差異的蛋白點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜分析,鑒定成功46個(gè),BioTools軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),得到5個(gè)重要差異的蛋白點(diǎn),編號(hào)分別為A1,B66,D15,D31,D39。蛋白相關(guān)信息見(jiàn)表1。3激素對(duì)小鼠正常生命活動(dòng)的影響通過(guò)對(duì)差異蛋白的分析,我們發(fā)現(xiàn)其按功能分別涉及細(xì)胞骨架,細(xì)胞遷移、黏附,能量代謝,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),分化增殖等方面,其中脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase,FASN),非肌肉肌球蛋白重鏈(nonmusclemyosinheavychain,NMHC),熱休克蛋白(heatshockprotein,HSP)和COP9對(duì)我們的研究有重要意義。FASN是體內(nèi)合成內(nèi)源性飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶,主要參與細(xì)胞的增殖、分化和機(jī)體能量及脂類代謝。FASN通過(guò)影響細(xì)胞增殖與脂肪酸代謝,與癌癥、肥胖、2型糖尿病和冠心病的危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。在動(dòng)脈粥樣硬化的研究中,FASN的主要產(chǎn)物棕櫚酸等飽和脂肪酸為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要成分。FASN還可利用NADPH還原酶通過(guò)縮合反應(yīng)合成新生內(nèi)源性脂肪酸,研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞的FSAN被抑制后膽固醇及甘油三酯含量均有所減少。本實(shí)驗(yàn)中激素干預(yù)后MSCs的FASN水平升高,表明激素可能引起其脂肪代謝紊亂及內(nèi)源性脂肪酸增多。NMHC是非肌肉肌球蛋白II(NMII)的組成部分,NMII可為細(xì)胞內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力,同時(shí)參與細(xì)胞遷移、黏附、胞質(zhì)分裂等各種生理活動(dòng),NMII被抑制后會(huì)造成細(xì)胞黏附能力的下降,有研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞敲除,可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間黏附缺失,小鼠不能發(fā)育成正常的內(nèi)臟內(nèi)胚層。激素干預(yù)后的MSCs的NMHC水平降低,表明其生長(zhǎng)、黏附等多項(xiàng)生命活動(dòng)受到影響。HSP是人體內(nèi)的一種應(yīng)激蛋白,在高溫、感染、創(chuàng)傷等應(yīng)激狀態(tài)下被誘導(dǎo)表達(dá),HSP可分為5類:小分子HSP(sHSP),HSP60,HSP70,HSP90和HSP110。HSP27屬sHSP家族,可阻斷應(yīng)激狀態(tài)下肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白絲的分裂,從而維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu),還可抑制Cytc釋放和Bax介導(dǎo)的線粒體傷害。HSP70可通過(guò)阻止細(xì)胞色素C釋放起到抗凋亡作用,并抑制凋亡誘導(dǎo)因子從而保護(hù)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中木豆葉含藥血清組MSCs中HSP的升高說(shuō)明其自我保護(hù)能力增強(qiáng)。COP9是一種核蛋白復(fù)合體,由S1-S8共8個(gè)亞單位組成,介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)廣泛的信號(hào)傳導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的S5參與了應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途經(jīng),MAPK途徑是調(diào)節(jié)MSCs分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。JNK通路在轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外信號(hào)至核轉(zhuǎn)錄因子時(shí)起重要作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)JNK能改變骨鈣素的mRNA水平,骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)從轉(zhuǎn)錄水平活化JNK,從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)中木豆葉含藥血清組COP9的升高說(shuō)明木豆葉可能對(duì)JNK通路產(chǎn)生影響。綜上所述,干細(xì)胞在受到大劑量激素的干預(yù)后,NMII被抑制影響了干細(xì)胞的正常生命活動(dòng),FASN水平的提高,增加了MSCs內(nèi)源性脂肪酸的產(chǎn)生,造成脂肪代謝紊亂。骨壞死是骨組織破壞大于修復(fù)的結(jié)果,激素的使用使血液黏稠度增高,血脂異常,股骨頭內(nèi)由于栓塞等原因造成供血不足、骨細(xì)胞壞死,上述兩種蛋白的變化干擾了MSCs正常的分化、修復(fù)作用,造成破壞大于修復(fù),形成股骨頭壞死。木豆葉干預(yù)后MSCs的FASN沒(méi)有顯著變化,故不能說(shuō)明木豆葉有通過(guò)此途徑減少細(xì)胞內(nèi)源性脂肪酸生成的作用,而HSP和COP9表達(dá)水平的顯著升高,提示其作用機(jī)理可能在于提高M(jìn)SCs的應(yīng)激性和自我保護(hù)作用,同時(shí)通過(guò)MAPK途徑促進(jìn)了MSCs的成骨分化從而加速修復(fù)骨壞死,這種促進(jìn)成骨分化的機(jī)制有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。傳至第3代的MSCs接種于75cm2培養(yǎng)瓶,增殖至培養(yǎng)瓶80%時(shí)分為3組:正常