野生杜鵑愈傷培養(yǎng)基的培養(yǎng)

野生杜鵑愈傷培養(yǎng)基的培養(yǎng)

杜鵑花是中國的傳統(tǒng)花之一。它也是世界著名的觀賞花卉，被稱為木本花之王。杜鵑花是一個大屬,全世界約有900余種,分布于歐洲、亞洲和北美洲,而以亞洲最多,有850種,其中我國有530余種,占全世界種類的59%,特別集中于云南、西藏和四川三省區(qū)的橫斷山脈一帶,是全世界杜鵑花的發(fā)祥地和分布中心。杜鵑種子極小,播種繁殖困難。另外,由于杜鵑花是典型的嗜酸性植物,且自然界中缺乏耐堿的杜鵑種質(zhì)資源,因此很難通過常規(guī)雜交育種方法獲得耐堿品種,這些原因極大限制了杜鵑花的開發(fā)和利用。通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以實現(xiàn)杜鵑花的快速繁殖,這對保護名貴杜鵑的種質(zhì)資源具有重要意義。1材料和方法1.1葉片離體培養(yǎng)由日照五蓮山采取的野生杜鵑花(Rhododendronsimsii)種子在無菌條件下發(fā)芽獲得試管苗,然后用無菌苗的葉片進行離體培養(yǎng)研究。1.2測試方法1.2.1創(chuàng)建吐溫80in先用20mg/L的GA3處理杜鵑花種子12h后,再用75%的酒精(每100ml酒精中添加1ml滅菌的吐溫80)浸泡3min,盡可能多的去掉較大雜物。然后在超凈臺上用0.1%的升汞消毒8min,再用10%的次氯酸鈉消毒10min,最后用無菌水沖洗3～4遍,用無菌槍頭接種到不含激素的1/4Anderson培養(yǎng)上。1.2.2誘導(dǎo)愈傷的檢測(1)種子接種在1/4Anderson培養(yǎng)基上,無菌發(fā)芽得到試管苗。(2)當(dāng)年采取的種子大約7天開始萌發(fā),1月后即可使用。摘取試管苗葉片切傷后接種到附加不同濃度的TDZ、ZT、2,4-D、NAA的1/4Anderson上,篩選出誘導(dǎo)愈傷的最佳激素配合比。每瓶20塊,重復(fù)5次,2周后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率。(3)芽誘導(dǎo):將愈傷組織接種到含不同濃度的TDZ、2-IP、ZT、IBA的1/4Anderson培養(yǎng)基上,每瓶20塊,重復(fù)5次。2周后統(tǒng)計芽分化率及愈傷組織塊上芽體數(shù)。(4)生根培養(yǎng):用不添加任何激素的1/4Anderson培養(yǎng)基進行4周壯芽培養(yǎng)后,將試管芽分別接種到不同配方的生根培養(yǎng)基中。4周后觀察生根情況,并統(tǒng)計生根結(jié)果,從中篩選出最佳生根培養(yǎng)基。(5)培養(yǎng)條件:培養(yǎng)溫度(25±2)℃,光照時間12h/d,光照強度2000～3000lx。蔗糖30g/L,pH4.8,瓊脂粉5g/L。2結(jié)果與分析2.1愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基從表1中可以看出,附加不同激素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)效果完全不同。我們進行組織培養(yǎng)的目的是為了實現(xiàn)杜鵑花快速繁殖,愈傷組織的好壞、多少決定了不定芽的質(zhì)量。因此,我們要獲得最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。上表結(jié)果表明:2,4-D1mg/L+TDZ0.1mg/L為最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。TDZ、ZT濃度低時誘導(dǎo)愈傷效果好,濃度提高或降低都會使愈傷率降低,愈傷塊生長狀況改變。高濃度的2,4-D與NAA使愈傷生長緩慢,并且降低了愈傷誘導(dǎo)率,加速了細胞老化。2.2-ip對愈傷組織增殖的影響為獲得大量不定芽,需要足夠的愈傷組織塊,因此在不定芽誘導(dǎo)前,我們進行了愈傷組織的繼代增殖。愈傷組織增殖培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。表2結(jié)果表明,TDZ濃度對不定芽的再生率有顯著影響,而2-IP可增加單個愈傷塊上的芽體數(shù)目。ZT在芽誘導(dǎo)過程中,需要較高濃度,這可能會導(dǎo)致芽苗玻璃化。因此我們在芽誘導(dǎo)過程中細胞分裂素多采用TDZ與2-IP,生長素則選用活性較低的IBA。2.3生根數(shù)降低不同激素對再生芽的生根率、生根數(shù)目影響程度不同。當(dāng)IBA濃度低于2mg/L時,再生芽的生根率及生根數(shù)與IBA濃度呈正相關(guān);IBA濃度如果繼續(xù)增加,生根率及生根數(shù)都會降低。此外,培養(yǎng)基中NAA濃度對再生芽的生根率也有顯著影響,當(dāng)NAA濃度低于0.1mg/L時可有效促進生根;如果再增加NAA濃度,生根率明顯降低,當(dāng)NAA濃度為0.5mg/L時,在根部則會出現(xiàn)明顯愈傷。另外,在NAA0.1mg/L的培養(yǎng)基上進一步對蔗糖(10g/L、20g/L、30g/L),活性炭(2g/L、4g/L、6g/L)篩選,結(jié)果表明蔗糖濃度與活性炭濃度對生根影響不大,但低濃度的活性炭可使芽苗健壯,葉片深綠。3生根培養(yǎng)基的使用3.1經(jīng)過以上試驗發(fā)現(xiàn)杜鵑花葉片誘導(dǎo)愈傷的最佳培養(yǎng)基為1/4Anderson+2,4-D1mg/L+TDZ0.1mg/L;芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是1/4Anderson+IBA0.1mg/L+TDZ1mg/L+2-IP0.5mg/L;生根培養(yǎng)基是1/4Anderson+NAA0.1mg/L。3.2植物生長調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)中起著重要而顯明的作用。生長素能夠誘導(dǎo)細胞分裂,促進細胞伸長,一般低濃度的生長素可促進生長,而濃度較高則會抑制植物生長;細胞分裂素主要是促進細胞分裂,誘導(dǎo)芽的形成和促進芽的生長。因此適當(dāng)?shù)募に嘏浔扔欣谟鷤M織的誘導(dǎo),不定芽的分化以及不定根的形成。3.3采用二步法誘導(dǎo)不定芽,在愈傷增殖階段,愈傷增殖代數(shù)不宜過多,過多繼代增殖會導(dǎo)致芽誘導(dǎo)率顯著下降,一