異喹啉生物堿生物合成與儲(chǔ)存機(jī)制研究進(jìn)展

異喹啉生物堿生物合成與儲(chǔ)存機(jī)制研究進(jìn)展

氨基化合物是一種含有氮的異環(huán)一般化合物，具有一定的毒性和活性。大約20%的植物可以產(chǎn)生大約20%的堿（yalaki，2006；faffshintianddeluka，2008）。生物堿一般在特殊的細(xì)胞中積累,它們有特殊的細(xì)胞毒性,具有防御作用(Hartmann,2004)。截至目前已發(fā)現(xiàn)大約有12000種生物堿具有生物活性。由于生物堿結(jié)構(gòu)和形式的多樣性使得其生物合成途徑也不相同(FacchiniandDeLuca,2008)。生物堿的生物合成和積累是在生物和非生物環(huán)境控制下完成的(DeLucaandSt-Pierre,2000)。根據(jù)生物堿的基本結(jié)構(gòu)類型可將其分為5類。第1類為異喹啉類生物堿。目前國內(nèi)外研究表明,罌粟科、毛茛科、小檗科和防己科等植物中發(fā)現(xiàn)的天然異喹啉生物堿大約有2500種,如有止痛麻醉效果的嗎啡、咳嗽抑制劑、肌肉松弛劑罌粟堿、抗菌劑血根堿和黃連素等。研究人員從罌粟科植物博落回(Macleayacordata)中分離得到的白屈菜紅堿(chelirubine)、血根堿(sanguinarine)、別隱品堿(allocryptopine)和原阿片堿(protopine)均為異喹啉類生物堿(羅忠勇等,2010;郭宇鴿等,2011;李文亮等,2011)。研究表明,上述生物堿具有抗腫瘤、抗炎和抗病毒等多種藥理作用(Newmanetal.,1999;Blanketal.,2010;程辟和曾建國,2012)。第2類為吡啶類生物堿,其作為化學(xué)生態(tài)學(xué)中的一個(gè)復(fù)雜化合物,同時(shí)也對植物有防護(hù)作用。對吡啶類生物堿的研究表明,吡啶類生物堿不像異喹啉生物堿是單一來源的生物堿,通過對關(guān)鍵酶的定位發(fā)現(xiàn)吡啶類生物堿具有多源性(Hartmann,2004)。第3類是莨菪烷類生物堿。莨菪生物堿是一類具有抗膽堿效果的化合物,如莨菪堿和東莨菪堿,一般出現(xiàn)在莨菪屬、顛茄屬和曼陀羅屬等植物中。第4類為吲哚類生物堿。其有近3000種結(jié)構(gòu),主要出現(xiàn)在夾竹桃科、馬錢科、茜草科等植物中。這類生物堿也有很強(qiáng)的生物活性,如蛇根堿(利血平)可作用于神經(jīng)障礙;長春花堿和長春新堿可以作為抗腫瘤成分;壯陽堿可作用于血管舒張等(FacchiniandDeLuca,2008)。第5類為有機(jī)胺類生物堿,如麻黃堿、秋水仙堿和益母草堿等。通過對生物代謝途徑中的關(guān)鍵酶定位,有助于弄清生物堿的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)藏位置,為人為調(diào)控生物堿的合成、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏多種綜合手段提高生物堿產(chǎn)量提供理論依據(jù)。鑒于此,本文將對異喹啉生物堿、吡啶生物堿、吲哚類生物堿和莨菪生物堿的代謝、合成、儲(chǔ)藏等相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。1反式心果堿和二氫血根堿為了掌握生物堿的合成、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏部位,有必要先弄清生物堿生物合成的整個(gè)途徑?，F(xiàn)以異喹啉類生物堿中的血根堿為例進(jìn)行說明。異喹啉類生物堿的生物合成途徑是從2種酪氨酸衍生物的縮合開始(FacchiniandDeLuca,2008),緊接著是一系列的反應(yīng)形成反式心果堿(DeLucaandSt-Pierre,2000),其主要是由苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸和鳥氨酸衍生出來的(Wink,1999),并產(chǎn)生多巴胺等。反式心果堿是大部分生物堿的中間及普遍的前體物質(zhì)(DeLucaandSt-Pierre,2000;FacchiniandDeLuca,2008),在合成血根堿的通路中,小檗堿橋接酶(berberinebridgeenzyme,BBE)將反式心果堿轉(zhuǎn)化成金黃紫堇堿。碎葉堿合成酶(cheilanthifolinesynthase,CFS)和人血草堿合成酶(stylopinesynthase,STS)通常與P450酶系的酶起作用,催化其形成2個(gè)亞甲基的橋接并產(chǎn)生反式人血草堿(LiscombeandFacchini,2007;Vrbaetal.,2011)。隨后,在四氫化小檗堿-順式-氮-甲基轉(zhuǎn)移酶(tetrahydroprotoberberinecis-N-methyltransferase,TNMT)的作用下將人血草堿轉(zhuǎn)化成(S)-順式-N-甲基人血草堿(LiscombeandFacchinietal.,2007)。另外2個(gè)P450酶:N-甲基人血草堿-14羥化酶(N-methylstylopine14-hydroxylase,MSH)和原阿片堿-6-羥化酶(protopine6-hydroxylase,P6H)都催化(S)-順式氮甲基人血草堿轉(zhuǎn)換成6-羥化原阿片堿,然后自發(fā)地重新排列形成二氫血根堿(Vrbaetal.,2011)。最終,二氫血根堿被二氫苯并啡啶氧化酶(dihydrobenzophenanthridineoxidase,DBOX)氧化成血根堿(Arakawaetal.,1992;Ignatovetal.,1996)(圖1)。別隱品堿和白屈菜紅堿從金黃紫堇堿的另一個(gè)通路開始生物合成,該通路與原阿片堿和血根堿的生物合成相似(Parketal.,2002)。2生物合成部位的細(xì)胞水平2.1原位雜交法測體外管及其它生物合成基因的作用通過對罌粟(Opiumpoppy)的代謝研究發(fā)現(xiàn),其生物堿可能是在篩管和伴胞中合成(FacchiniandDeLuca,2008)。對代謝酶的研究發(fā)現(xiàn),罌粟含有的絡(luò)氨酸多巴脫羧酸酶的基因表達(dá)僅限于莖和根維管組織中的次生韌皮部和初生木質(zhì)部(DeLucaandStPierre,2000)。利用原位雜交技術(shù)對罌粟生物堿中的關(guān)鍵酶小檗堿橋接酶的表達(dá)進(jìn)行定位,發(fā)現(xiàn)其在大多數(shù)器官韌皮部的篩管和伴胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,且其它關(guān)鍵酶,如反式-氮-甲基烏藥堿-3-羥化酶((S)-N-methylcoclaurine3′-hydroxylase,CYP80B1)和可待因酮還原酶(codeinonreductase,COR)也在同一器官的同一位置表達(dá)。對乳汁管的觀察發(fā)現(xiàn)其在植物的各個(gè)器官都有出現(xiàn),且都出現(xiàn)在小檗堿橋接酶出現(xiàn)位置的周圍,直徑一般大于30μm;同時(shí),對罌粟乳汁的主要成分乳膠蛋白(majorlatexprotein,MLP)的定位發(fā)現(xiàn)其僅出現(xiàn)在乳汁管的細(xì)胞質(zhì)處(FacchiniandDeLuca,1995;Birdetal.,2003)。研究顯示乳汁管與生物堿的儲(chǔ)藏相關(guān),而與其合成無關(guān)(Birdetal.,2003)。罌粟生物堿合成通路中的第1步起催化作用的酪胺酸脫羧酶的基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在韌皮部而不是乳汁管,其它的酶,如norcoclaurine6-O-methyltransferase(6OMT)、CNMT(coclaurineN-methyltransferases)、烏藥堿-氮-甲基轉(zhuǎn)移酶、氮-甲基烏藥堿3′-羥化酶、3′-羥基-氮-甲基烏藥堿4′-甲氧基轉(zhuǎn)移酶和salutaridinol7-O-acetyltransferase(SalAT)的定位出現(xiàn)在篩管,但其基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在相關(guān)的伴胞中(Samananietal.,2006)。利用原位雜交法對異喹啉生物堿代謝中間物的定位結(jié)果表明,篩管與乳汁管中成分不同(篩胞中出現(xiàn)的是生物堿生物合成酶,乳汁管中出現(xiàn)的是生物堿)可能是由于細(xì)胞間運(yùn)輸?shù)氖呛铣赏分械拿负彤a(chǎn)生的中間產(chǎn)物,而非最終產(chǎn)物。這打破了傳統(tǒng)的植物生物學(xué)中對篩管功能的定義。目前發(fā)現(xiàn)篩管具有運(yùn)輸大分子物質(zhì),如RNA(Jorgensenetal.,1998)、抗壞血酸(Hancocketal.,2003)、茉莉酸(Hauseetal.,2003)和有防御作用的化合物的潛能。利用免疫熒光定位的方法對黃唐松草(Thalictrumflavum)中積累的異喹啉生物堿(如黃連素等)進(jìn)行分析,表明異喹啉生物合成基因在根和根狀莖中表達(dá)(Samananietal.,2005),根中的9個(gè)酶被定位到中柱鞘和鄰近的皮層細(xì)胞中(圖2A中紅色和紫色部位所示)(ZieglerandFacchini,2008)。對小檗科植物的研究發(fā)現(xiàn)黃連素在培養(yǎng)細(xì)胞的胞內(nèi)囊泡(intracellularvesicles)(也可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中合成(Yazaki,2006)。小檗堿合成酶基因的轉(zhuǎn)錄僅限于根中非成熟區(qū)的內(nèi)皮層細(xì)胞和中柱鞘細(xì)胞,還有一部分在葉原基的原表皮層中進(jìn)行(Samananietal.,2005)。此外,對茄科植物的研究發(fā)現(xiàn),根中的中柱鞘是四氫異喹啉生物堿的制造中心,中柱鞘最接近木質(zhì)部,可能木質(zhì)部協(xié)助其運(yùn)輸生物堿到葉片并積累(DeLucaandSt-Pierre,2000)。2.2千里光屬植物的化合物酶活性變化在大麻葉澤蘭(Eupatoriumcannabinum)中,作為吡啶類生物堿生物合成的關(guān)鍵酶高精脒合酶(homospermidinesynthase,HSS)出現(xiàn)在根的整個(gè)皮層細(xì)胞(不包括內(nèi)皮層和外皮層)中(Ankeetal.,2004)。在千里光屬(Senecio)植物中,作為吡啶類生物堿生物合成中的千里光堿N-氧化物產(chǎn)生于根,然后通過韌皮部運(yùn)輸?shù)街参锏牡厣喜糠?HartmannandDierich,1998),隨后通過脫氫作用、環(huán)氧化作用和羥基化等反應(yīng)使其在不同的植物中生成不同的吡啶類生物堿(ZieglerandFacchini,2008)。對千里光(Senecioscandens)植物的酶定位研究發(fā)現(xiàn),在吡啶類生物堿合成通路中的酶HSS出現(xiàn)在根的內(nèi)皮層和韌皮部附近的皮層處(圖2A中紫色細(xì)胞所示)。在澤蘭屬(Eupatorium)植物中發(fā)現(xiàn)高精脒合酶貫穿于根的皮層(圖2A中藍(lán)色細(xì)胞所示)(Ankeetal.,2004)。在千里光中,吡啶生物堿的合成發(fā)生在韌皮部附近的內(nèi)皮層和皮層細(xì)胞中(Molletal.,2002)。2.3香葉醇、胡豆合酶和環(huán)已烷體的免疫細(xì)胞吲哚類生物堿出現(xiàn)在長春花(Catharanthusroseus)的不同器官的不同細(xì)胞中,其代謝通路中的色氨酸脫羧酶和胡豆合酶在根中大量分布(St-Pierreetal.,1999),也有如水甘草堿-16-羥化酶(St-PierreandDeLuca,1995),desacetoxyvindoline4-hydroxylase(D4H)(St-Pierreetal.,1998)和deacetylvindoline4-O-acetyltransferase(DAT)(Flotaetal.,1997)僅僅出現(xiàn)在起光合作用的幼嫩葉片和其它器官頂端,此處多出現(xiàn)文多靈生物堿。利用原位雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)法對色氨酸脫羧酶和胡豆合酶定位,發(fā)現(xiàn)它們都出現(xiàn)在莖的表皮、葉、花蕾、根尖分生組織中(St-Pierreetal.,1999;Irmleretal.,2000),對于D4H及DAT出現(xiàn)在乳汁管和幼嫩部位的異型細(xì)胞中,但是沒有在根中出現(xiàn),乳汁管和異型細(xì)胞貫穿于葉片的葉肉組織中(Burlatetal.,2004;Oudinetal.,2007)(圖2B)。吲哚類生物堿合成相關(guān)酶至少與3種不同類型的細(xì)胞相關(guān),長春花堿植物中香葉醇10-羥化酶存在于植物地上部分器官的韌皮部薄壁組織中(Burlatetal.,2004);色氨酸脫羧酶、開聯(lián)番木鱉苷和胡豆合酶定位在地上部分器官的表皮層和根的頂端分生組織中(St-Pierreetal.,1999;Irmleretal.,2000);D4H、DAT僅出現(xiàn)在乳汁管、莖和葉的異型細(xì)胞中(St-Pierreetal.,1999)。因此,文多靈通路上的中間產(chǎn)物在不同類型的細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)(ZieglerandFacchini,2008)。2.4紅色細(xì)胞和酮還原酶莨菪烷類生物堿合成過程中的腐胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)和莨菪堿-6β-羥化酶出現(xiàn)在顛茄(Atropabelladonna)和天仙子(Hyoscyamusniger)植物根的中柱鞘中(Hashimotoetal.,1991;Suzukietal.,1999a,1999b)(圖2A中紅色細(xì)胞所示);同時(shí)在生成莨菪堿代謝通路中的中間關(guān)鍵酶莨菪酮還原酶I(tropinonereductaseI,TR-I)被定位在植物內(nèi)皮層和鄰近的皮層細(xì)胞中(NakajimaandHashimoto,1999)。莨菪酮還原酶II(tropinonereductaseII,TR-II)被定位于馬鈴薯(Solanumtuberosum)韌皮部的篩管中(Kaiseretal.,2006)。在顛茄中,莨菪烷類生物堿的合成酶被定位在中柱鞘細(xì)胞中(Hashimotoetal.,1991)。顛茄根的中柱鞘是莨菪烷類生物堿的制造中心,且其鄰近的木質(zhì)部可能將生物堿運(yùn)輸?shù)饺~片儲(chǔ)藏(DeLucaandSt-Pierre,2000)。3為細(xì)胞水平的生物運(yùn)輸和儲(chǔ)存場所3.1不同細(xì)胞間異喹啉衍生物的轉(zhuǎn)運(yùn)對罌粟的代謝研究發(fā)現(xiàn)罌粟中的生物堿在維管束伴胞鄰近的乳汁管中積累(Birdetal.,2003;Samananietal.,2005)。對其生物堿合成途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行定位,發(fā)現(xiàn)合成通路中中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生在不同形式的細(xì)胞中(ZieglerandFacchini,2008)。通過酶催化步驟發(fā)現(xiàn)罌粟生物堿在乳汁管中累積,乳汁管在次生木質(zhì)部(DeLucaandSt-Pierre,2000)。煙草中產(chǎn)生的尼古丁被轉(zhuǎn)移到地上部分積累,在這個(gè)轉(zhuǎn)移過程中生物堿進(jìn)入木質(zhì)部,然后停留在葉肉細(xì)胞,最終在液泡中積累(Yazaki,2006)。黃連(Coptisjaponica)細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后的熒光顯微觀察結(jié)果顯示,在培養(yǎng)基中加入的黃連素通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-bindingcassettetransporter)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),然后聚集到液泡中(Yazaki,2006)。在蕓香(Rutagraveolens)中,生物堿的積累與內(nèi)皮層細(xì)胞有關(guān)(Samananietal.,2005)。在罌粟中,異喹啉生物堿的積累出現(xiàn)在有節(jié)乳汁管及鄰近的韌皮部的篩管。唐松草植物積累生物堿,如黃連素。利用鳶尾(Iristectorum)RNA雜交發(fā)現(xiàn)異喹啉生物堿的合成基因在其植物的根和根狀莖中。在根部,9種酶的基因在中柱鞘和鄰近的皮層細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄;而在根狀莖中,所有生物合成的酶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在葉原基的原表皮層中(Samananietal.,2005)。與一般的細(xì)胞相比,乳汁管細(xì)胞壁厚,在形態(tài)學(xué)觀察上較容易觀察到乳汁管。采用免疫熒光檢測法對罌粟乳汁管進(jìn)行定位,發(fā)現(xiàn)在根部,乳汁管貫穿于次生韌皮部,散布在薄壁細(xì)胞中;在莖部,乳汁管要比根中的大且相對于篩管和伴胞離皮層近,葉片中的乳汁管大多也是在韌皮部的遠(yuǎn)軸端(Birdetal.,2003)。使用激光顯微切割技術(shù)結(jié)合LC-Q/TOF-MS,研究青風(fēng)藤(Sinomeniicaulis)中6種生物堿在其表皮、皮層、石細(xì)胞、中柱鞘、維管束和髓等組織中的代謝累積分布,并同時(shí)實(shí)現(xiàn)了生物活性成分的組織定位和定量定性分析(Yietal.,2012)。綜上所述,異喹啉類生物堿的合成部位主要有皮層細(xì)胞(包括內(nèi)皮層)、中柱鞘和木質(zhì)部;而生物堿的轉(zhuǎn)運(yùn)是發(fā)生在不同細(xì)胞之間的,如韌皮部與乳汁管、伴胞與篩管之間;生物堿的積累主要發(fā)生在內(nèi)皮層和乳汁管中。乳汁管不僅能儲(chǔ)存分泌物,而且還具有運(yùn)輸作用。3.2長春花堿的代謝途徑莨菪生物堿代謝過程中涉及的腐胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶出現(xiàn)在根的中柱鞘,而莨菪酮還原酶I只出現(xiàn)在內(nèi)皮層和外皮層,H6H只在根中表達(dá),且鳥氨酸、腐胺前體物和精氨酸通過導(dǎo)管運(yùn)輸?shù)街兄?其它的中間產(chǎn)物和N-甲基腐胺被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)皮層,為下一步轉(zhuǎn)變成托品堿做準(zhǔn)備(DeLucaandSt-Pierre,2000)。在長春花的葉中,單萜類吲哚生物堿的代謝途徑被認(rèn)為是在韌皮部、表皮、乳汁管和異形細(xì)胞中進(jìn)行(Burlatetal.,2004)。通過對長春花堿的研究,發(fā)現(xiàn)文多靈生物堿生物合成的中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)是從韌皮部到表皮、表皮到乳汁管和異型細(xì)胞(圖3中綠色細(xì)胞所示)(ZieglerandFacchini,2008)。長春花屬植物根能積累很多生物堿,包括長春堿、水甘草堿及其衍生物。因此,很有可能是由根產(chǎn)生的長春堿和水甘草堿前體物在木質(zhì)部和與乳汁管相關(guān)聯(lián)的管胞的運(yùn)輸下運(yùn)輸?shù)饺橹?在乳汁管中水甘草堿轉(zhuǎn)變成文多靈,然后在非特異性的過氧化物酶的作用下長春堿變成長春花堿和長春新堿(DeLucaandSt-Pierre,2000)。4對長春花堿的生物合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果目前,對于生物堿生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲(chǔ)在亞細(xì)胞水平的定位也有了進(jìn)展。如在異喹啉生物堿研究中,與之相關(guān)的生物合成酶定位在不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中;在血根堿通路上,小檗堿橋接酶和P450加氧酶被定位到微粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(TanahashiandZenk,1990;BauerandZenk,1991)。也有報(bào)道稱血根堿合成通路中涉及的N-甲基轉(zhuǎn)移酶與葉綠體內(nèi)囊體相關(guān)。催化小檗堿生物合成最后幾步的小檗堿橋接酶和四氫小檗堿氧化酶與植物液泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)(DeLucaandSt-Pierre,2000)。罌粟中的異喹啉生物堿在細(xì)胞質(zhì)或罌粟乳汁中積累,嗎啡和相關(guān)的次生代謝物都存儲(chǔ)在罌粟的囊泡中,以便于在乳汁管中合成(Birdetal.,2003)。對白羽扇豆(Lupinusalbus)的研究表明,盡管葉綠體可能是形成喹諾里西啶骨架的場所,但是其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾應(yīng)是出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和線粒體的胞內(nèi)運(yùn)輸之后(DeLucaandSt-Pierre,2000)。吲哚生物堿生物合成中的水甘草堿通常與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表面相關(guān),其中胡豆苷合酶被定位到液泡中,其生物合成通路中所涉及的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面、液泡、葉綠體類囊體和細(xì)胞質(zhì)隔室(cytoplasmiccompartment)(DeLucaandSt-Pierre,2000)。對長春花堿通路中酶定位表明其至少與5種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān),如色氨酸脫羧酶、D4H、DAT出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)(DeLucaandCutler,1987);胡豆合酶和過氧化物酶出現(xiàn)在液泡中(McKnightetal.,1990,1991);異胡豆苷-β-葡糖苷酶是可溶性酶,可能與細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)(Stevensetal.,1993);氮-甲基轉(zhuǎn)移