草莓酒發(fā)酵菌株的篩選及發(fā)酵特性研究

草莓酒發(fā)酵菌株的篩選及發(fā)酵特性研究

草莓是薔薇科多年生草本植物。有各種各樣的東西。這些水果又紅又亮，柔軟多汁，酸甜可口，聞起來很香。具有清熱消火、脾胃調(diào)解酶、明朝養(yǎng)肝、預(yù)防心血管疾病等多種營養(yǎng)素。由于草莓果肉柔軟多汁、水分含量高、呼吸強度大、果皮較薄、耐貯性差,再加上生產(chǎn)季節(jié)性強,成熟收獲期較為集中,導(dǎo)致果實貯藏運輸中腐爛比例較高。我國近年來草莓種植面積和產(chǎn)量迅速增加,因此對草莓的深加工勢在必行。將草莓,包括難以鮮銷的殘次草莓加工成優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵果酒是減少草莓損失、提高草莓產(chǎn)品附加值的重要途徑之一,將有廣闊的市場前景。香氣成分是決定果酒風(fēng)味、質(zhì)量與典型性的主要因素。影響果酒香氣成分的因素很多,其中酵母菌種是決定果酒色澤、香氣、感官質(zhì)量和風(fēng)格的一個非常重要的因素。國內(nèi)外有關(guān)果酒的香氣成分組成和含量已有大量研究,近年來的工作重點已轉(zhuǎn)移到對香氣成分的影響因素。影響香氣成分的因素研究主要集中在發(fā)酵方式、超高壓催陳老化等方面,而釀酒菌種對其影響研究較少,且只見對葡萄酒有相關(guān)報道,草莓酒在該項的深入研究至今尚未見報道。本實驗采用氣相色譜法分析自選酵母菌株D、E、H發(fā)酵的草莓酒在發(fā)酵過程中主要香氣成分的變化,并通過對降糖速率、產(chǎn)酒精能力、產(chǎn)酸量及感官質(zhì)量評價,比較不同菌株的發(fā)酵特性,考察酵母菌種對草莓酒香氣成分變化的影響,以期為草莓酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。1材料和方法1.1試劑、儀器和儀器豐香草莓購于大連市水果批發(fā)市場。菌株A為本實驗室保存菌(釀酒酵母),菌株D、E、H為本實驗室自選菌。YEPD培養(yǎng)基:酵母浸粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL,pH6.0,115℃濕熱滅菌20min。果膠酶(酶比活力20萬U/g)河南洛陽夏盛果汁果膠酶有限公司;二氯甲烷(AR)北京北化精細化學(xué)品有限責(zé)任公司;丁酸乙酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、正丁醇、乙酸正戊酯、己酸甲酯、異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇天津基準化學(xué)試劑有限公司。S-3C雷磁pH值計上海精密科學(xué)儀器有限公司;WYT-5手持糖量折光儀上海大慶光學(xué)儀器廠;FID檢測器山東經(jīng)緯分析儀器有限責(zé)任公司;N2000色譜工作站浙江大學(xué)智達信息工程有限公司。1.2選擇菌株的鑒定篩選菌株的菌落和細胞形態(tài)鑒定、生理生化特性實驗參照《微生物學(xué)實驗手冊》。1.3草坪酒的制備工藝1.4培養(yǎng)條件:l一級種子液:從斜面上挑取兩環(huán)酵母菌,分別接入5mL10g/mL的糖水中,30℃恒溫培養(yǎng)24h。二級種子液:將一級種子液接入100mL的草莓稀釋汁(V汁:V水=1:1)中,30℃搖床培養(yǎng)24h,使酵母菌數(shù)達到1×109CFU/mL。1.5草莓酒的感官評估1.6質(zhì)量分析方法酒精體積分數(shù)、還原糖和滴定酸含量的測定參照GB/T15038—1994《葡萄酒、果酒通用試驗方法》;pH值采用S-3C雷磁pH值計測定;可溶性固形物采用WYT-5手持糖量折光儀測定;草莓酒香氣成分采用GC7890Ⅱ氣相色譜儀測定。氣相色譜分析樣品處理方法:用8層紗布過濾草莓酒,取過濾樣20mL,加入等量水蒸餾,收取餾分35mL,分別用15、10、10mL二氯甲烷萃取3次,每次萃取30min,合并有機相,取少量萃取液用于酒精體積分數(shù)的測定。將萃取液濃縮至1mL,供氣相色譜分析。氣相色譜分析條件:FFAP石英毛細管色譜柱(30m×0.32mm,0.5μm);起始溫度40℃,保持5min,以15℃/min升至180℃,保持5min;進樣口溫度250℃,檢測器溫度250℃;載氣:N2:30mL/min,H2:30mL/min,空氣:300mL/min;分流比1:50,柱前壓0.1MPa,進樣量1μL。2結(jié)果與分析2.1選擇菌株的形態(tài)特征通過菌落和細胞形態(tài)及生理生化特性分析(表2、3),初步鑒定菌株D為漢遜氏酵母屬、菌株E為克勒克酵母屬、菌株H為裂殖酵母屬。2.2種常用內(nèi)容對比對4株酵母菌發(fā)酵所得草莓酒進行感官評定,由實驗室成員組成評定小組參照GB/T15038—1994相關(guān)內(nèi)容進行品評,結(jié)果見表4。由表4可知,菌株H發(fā)酵的草莓酒呈琥珀紅色,澄清透亮,酒體豐滿醇厚,果香酒香濃郁,具有草莓特有的香氣,口味純正、柔和協(xié)調(diào)、風(fēng)格典型,明顯優(yōu)于其他菌株發(fā)酵的草莓酒,感官評定分數(shù)較高。2.3不同菌種的還原糖和可溶性固糖含量變化規(guī)律草莓酒中的還原糖和可溶性固形物含量直接影響酒精產(chǎn)量、酒的口感和風(fēng)味,是釀酒工業(yè)中控制生產(chǎn)和決定工藝的重要參數(shù)。在一定范圍內(nèi),糖分增加可提高發(fā)酵酒精體積分數(shù),但糖分過高,在提高酒精體積分數(shù)的同時,也提高某些高級醇、琥珀酸等副產(chǎn)物的生成量,導(dǎo)致果酒口味苦澀刺喉。由于草莓含糖量低,本實驗采用一次加糖法將含糖量調(diào)至22%進行發(fā)酵。分離菌株發(fā)酵草莓酒的還原糖和可溶性固形物含量變化見圖1、2。由圖1、2可知,4種酵母菌的還原糖和可溶性固形物含量變化趨勢相近。發(fā)酵初期還原糖含量均有所上升,因為發(fā)酵體系呈酸性環(huán)境(pH3.33),加入的蔗糖在酸性條件下水解,導(dǎo)致還原糖含量升高。前8d發(fā)酵處于旺盛時期,含糖量急劇下降;8~12d變化幅度較小,表明主發(fā)酵過程已完成。盡管趨勢相同,但不同酵母菌種的還原糖含量和可溶性固形物含量差異較大。菌株D的還原糖含量和可溶性固形物含量與對照菌株A相近,菌株E和菌株H的含量明顯低于對照菌株A。菌株H起酵速度快,糖分利用率高,發(fā)酵徹底,發(fā)酵結(jié)束時還原糖含量降至1.83g/L,可溶性固形物含量降至8.65%。這與菌株H的生長和繁殖速率較快密切相關(guān)。2.4發(fā)酵草莓酒的ph值及滴定酸含量分析草莓果實中的酸類物質(zhì)主要為有機酸,其中檸檬酸占總酸量的80%~90%。草莓汁發(fā)酵液初始酸含量要適宜,酸含量過低,pH值過高,不利于酵母菌的生長代謝;酸含量過高,pH值過低,則影響果酒的口感和風(fēng)味,故起始發(fā)酵液選擇草莓汁自然pH3.33。分離菌株發(fā)酵草莓酒的pH值和滴定酸含量變化見圖3。如圖3所示,滴定酸含量均呈上升趨勢,其中菌株E的滴定酸含量增長速度快,含量高,其后依次是菌株H、菌株D和菌株A。發(fā)酵過程中pH值均呈小幅度(3.17~3.33)下降趨勢,且不同菌株間的pH值差異不大。發(fā)酵過程中乙醇氧化為乙酸,如果生成具有芳香氣味的低級酯的能力較弱,就累積有機酸,滴定酸含量升高就較多;如果乙醇氧化為乙酸的能力較弱或大部分乙酸生成了低級酯,且酵母菌生長繁殖旺盛消耗一部分蘋果酸、檸檬酸和大多數(shù)氨基酸,則滴定酸含量升高就較少。草莓發(fā)酵液也具有一定的緩沖作用。2.5酒精體積分數(shù)月內(nèi)日分數(shù)不同酵母對原料的利用率及產(chǎn)乙醇能力不同。分離菌株發(fā)酵草莓酒的酒精體積分數(shù)變化如圖4所示。由圖4可知,菌株D、E、H發(fā)酵草莓酒的酒精體積分數(shù)變化趨勢相同,前8d酒精體積分數(shù)持續(xù)快速增長,8~12d增長較緩慢。原因是前期酵母細胞大量繁殖,能將更多的糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酒精,發(fā)酵旺盛,產(chǎn)酒精速率快;到后期,部分酵母細胞由于營養(yǎng)成分不足等原因開始衰亡,產(chǎn)酒精速率減慢。比較酒精體積分數(shù)變化曲線發(fā)現(xiàn),菌株D和菌株E產(chǎn)酒精能力差異不大,菌株H稍高于二者,酒精體積分數(shù)達12.92%,各菌株均較對照菌株A起酵快,但發(fā)酵結(jié)束時酒精體積分數(shù)均較對照菌株略低。2.6發(fā)酵草莓酒香氣成分的變化果酒的香味取決于大量具有香味的化合物,包括來自于原汁的果香,來自于酵母菌、細菌發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵香味以及老化過程中形成的香味物質(zhì)。草莓酒具有自身獨特的香氣成分,至今已知的香氣成分在300種以上,主要是在發(fā)酵過程中由酵母產(chǎn)生的酯類和醇類。其中,異丁醇具有酒香和植物草味;異戊醇具有酒香和果香;乳酸乙酯具有較強的酒香氣味,是清香型酒的主體香氣;而β-苯乙醇具有清甜玫瑰的香氣,香氣柔和但不持久。菌株發(fā)酵草莓酒香氣成分的氣相色譜分析結(jié)果見表5。由表5可知,草莓酒的香氣成分主要為醇類和酯類,其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、正丙醇、乙酸異戊酯、正丁醇、乳酸乙酯、異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇含量占總含量的91.5%,菌株A、D、E、H的這9種香氣成分總含量分別為18.54、30.81、26.61mg/L和37.42mg/L。4種酵母菌發(fā)酵的草莓酒排在前3位的香氣成分相同,分別是異戊醇、β-苯乙醇和異丁醇,說明各酵母所產(chǎn)主要香氣成分一致,但主要香氣成分的含量不同,因此決定了草莓酒香氣質(zhì)量。發(fā)酵過程中各種物質(zhì)的含量變化差異很大,其中乙酸乙酯、正丙醇和異丁醇含量持續(xù)上升,乙酸異戊酯、正丁醇、乳酸乙酯、異戊醇和β-苯乙醇在接近發(fā)酵結(jié)束時有小幅度回落,而丁酸乙酯含量變化甚微。菌株A產(chǎn)正丁醇能力最強,菌株D產(chǎn)乙酸異戊酯能力最強,誤差范圍內(nèi)4株菌產(chǎn)丁酸乙酯的含量無明顯影響,菌株H的其余各