基于代謝組學技術的四逆散抗肝損傷的生物標志物研究

基于代謝組學技術的四逆散抗肝損傷的生物標志物研究

代謝組是一門定量的生物系統(tǒng)外源性代謝組規(guī)律，它通過刺激或干擾生物系統(tǒng)，如內源性代謝組，闡明生命代謝活動的生物學活動性質。代謝組學全景式、整體互動性的特點與中藥復方“多途徑”、“多層次”、“多靶點”的整體作用理論相一致。四逆散為東漢張仲景《傷寒論》首載,由柴胡、白芍、枳實、甘草四味藥物等份組成,具有解郁透熱、疏肝理脾之功效。近代藥理學研究也證明四逆散對多種實驗性肝損傷有明顯的改善作用。本室對其化學成分、內在質量、藥物動力學和藥效學等方面進行了系統(tǒng)研究。但迄今為止,四逆散的藥理研究還僅限于臨床或實驗藥效學研究階段,未見從代謝組學的角度在分子水平上探討其整體藥效的報道。本實驗采用代謝組學的研究策略,以UPLC-MS/MS技術結合多元統(tǒng)計分析方法研究大鼠血清代謝物譜的變化,從而闡述四逆散抗肝損傷可能的作用機制。動物的基本情況藥材及樣品制備柴胡(市售)為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)的干燥根,白芍(市售)為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根,枳實(市售)為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)的干燥幼果,甘草(市售)為豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根及根莖。以上藥材均由沈陽藥科大學藥用植物教研室路金才教授鑒定。按四逆散原方配比稱取藥材粗粉適量,加入12倍量水,浸泡50min,回流提取3次,每次30min,合并濾液,濃縮。75%乙醇醇沉,靜置過夜,濃縮至干。提取物用0.5%CMC-Na溶液溶解,制成灌胃劑(4kg·L-1),于4℃保存?zhèn)溆?。試藥與儀器對照品:C16∶0、C18∶0、C18∶1溶血磷脂酰膽堿(美國Sigma公司);苯丙氨酸、色氨酸(天津市博迪化工有限公司)。水飛薊素膠囊(德國馬博士大藥廠);CCl4為分析純(天津康科德試劑公司);乙腈(TEDIA公司)、甲酸(Dikma公司)均為色譜純,去離子水(杭州娃哈哈純凈水公司)。ACQUITYUltraPerformanceLCTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司),WatersQuattroMicroAPI三重四極桿串聯(lián)質譜儀配備電噴霧離子源(美國Waters公司)。動物SPF級SD雄性大鼠32只,體重220~300g,由沈陽藥科大學實驗動物中心提供,合格證號SCXK(遼)2010-0001。動物分組與給藥32只大鼠隨機分為4組,分別為正常對照組、模型組、陽性對照組(水飛薊素)、四逆散組。陽性對照組(30mg·kg-1)與四逆散組(10mL·kg-1)每天灌胃給藥1次,連續(xù)5天。正常對照組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水。于末次給藥后2h,除正常對照組外,腹腔注射新鮮配制的40%CCl4大豆油溶液(3mL·kg-1),正常對照組注射等體積大豆油。樣品的采集和預處理大鼠造模24h后,腹腔注射10%水合氯醛水溶液(3mL·kg-1)麻醉,腹主動脈取血置于不涂肝素鈉的離心管中,室溫放置2h后,4℃離心15min(13000r·min-1),取上清血清,-80℃保存待測。分析前將血清樣品于室溫下解凍,取血清200μL,加入乙腈600μL,渦流30s,離心10min(13000r·min-1),取上清700μL,40℃N2流下吹干,殘渣用水-乙腈(90∶10)100μL復溶,渦旋30s,離心5min(13000r·min-1),取上清液進樣分析。色譜和質譜條件色譜條件:ACQUITYUPLCTMBEHC18柱(2.1mm×100mm,1.7μm,美國Waters公司),流動相0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B),流速0.25mL·min-1,柱溫40℃,樣品室溫度4℃,進樣量5μL。梯度洗脫:0~0.5min,100%A;0.5~20min,0%~95%B;20~21min,95%B。質譜條件:電噴霧離子化源(ESI);正負離子同時掃描;全掃描(FullScan),掃描范圍m/z100~1000;毛細管電壓為3.0kV(ESI+),2.8kV(ESI-);錐孔電壓為35V;源溫度為120℃;脫溶劑氣為N2,脫溶劑氣溫度為350℃,脫溶劑氣體積流量為400L·h-1;錐孔氣體積流量為30L·h-1;碰撞氣為Ar。數(shù)據處理采用MarkerlynxV4.1工作站(美國Waters公司)對采集得到的譜圖進行峰識別、匹配和歸一化等處理后,得到由保留時間-質荷比、樣本名稱和歸一化后的離子強度組成的三維矩陣。導入到SIMCA-P11.5(Umetrics,Umea,Sweden)軟件包進行PCA分析,產生得分矢量圖(scoreplot)用以獲得樣品分類信息,載荷矢量圖(loadingplot)用以發(fā)現(xiàn)潛在的生物標志物。結果1不同濃度正負離子模式下大鼠的肝臟損傷模型分析采用UPLC-MS進行血清樣品的分離和數(shù)據采集,圖1為典型大鼠血清樣品正、負離子模式下的基峰離子流色譜圖(BPI)。為了考察肝損傷模型大鼠體內代謝的變化,將正常對照組大鼠和模型組大鼠的UPLC-MS數(shù)據進行PCA分析,得出反映兩組大鼠組間離散程度的得分圖(圖2)和尋找相關生物標志物的載荷圖(圖3)。由得分圖可知,在正負離子模式下兩組大鼠均可實現(xiàn)明顯分離(R2X分別為0.892和0.871),表明肝損傷模型建立成功。根據載荷圖找到了對兩組分離貢獻較大的代謝物,并對這些代謝物歸一化后的離子強度進行t檢驗,來確定潛在的生物標志物。2衍生物物質及鑒定潛在標志物的鑒定方法為通過一級質譜信息確定相對分子量,利用二級質譜信息獲得其結構碎片信息。查閱HMDB、KEGG、MassBank和METLIN等在線數(shù)據庫,對比標志物的一級、二級質譜信息,完成代謝物的鑒定,并使用對照品進行更進一步的驗證。以正離子模式下tR_m/z為17.8_524.5的代謝物為例說明其鑒定過程。圖4為該代謝物在正、負離子模式下的一級、二級質譜圖。除代謝物的準分子離子m/z524.5([M+H]+)外,還可見m/z546.5([M+Na]+)。圖4b可見m/z568.5([M+HCOO]-)和m/z508.5([M-CH3]-)。因此推測代謝物的相對分子質量為523。圖4c可見m/z184.0和m/z103.8的離子峰,這兩個離子為磷酯酰膽堿(PC)類物質的典型碎片離子,推測此代謝物可能屬于磷酯酰膽堿類物質。此外,圖4c中還出現(xiàn)m/z506.3([M+H-H2O]+)的碎片離子,說明此代謝物可能含有羥基,故進一步推測它可能屬于溶血磷酯酰膽堿類化合物。圖4d中出現(xiàn)了m/z283.3的響應很強的離子,可能為溶血磷酯酰膽堿中的脂肪酸鏈,根據脂肪酸的結構通式推測其可能為[C17H35COO]-。最后通過對照品比對,鑒定此代謝物為C18∶0LPC。其他代謝物采用相同的方法進行鑒定。對于tR15.9min(m/z319.3)的代謝物,通過一級、二級質譜信息,參考文獻及查閱METLIN等在線數(shù)據庫,都未完成其鑒定。但是經過PCA分析,發(fā)現(xiàn)此代謝物對分組的貢獻很大,不能忽略,本課題組正在對其進行更進一步的結構鑒定分析。結合載荷圖、t檢驗及代謝物的鑒定,在血清UPLC-MS代謝組學研究中共找到10種發(fā)生顯著變化的標志物(表1),鑒定出9種。結果表明,與正常組相比,模型組大鼠血清中苯丙氨酸、色氨酸、GCDCA代謝物的水平均顯著升高;溶血磷脂酰膽堿類物質LPC16∶0、LPC18∶0、LPC18∶1、LPC16∶1、LPC20∶4、LPC22∶6等6種代謝物的水平均顯著降低。這些發(fā)生顯著性變化的代謝物預示著肝損傷大鼠體內的多個代謝途徑發(fā)生了異常,涉及到體內的氨基酸代謝、脂代謝、膽汁酸代謝以及體內氧化-抗氧化作用平衡的改變。3逆散對大鼠體物質的影響為考察四逆散對肝損傷模型大鼠血清代謝物譜的影響,將正常對照組、模型組、陽性對照組與四散給藥組大鼠的正、負離子模式下的血清代謝物譜別采用PCA進行模式識別,得到4組大鼠的得分(圖5)。從圖中可以看出給予四逆散、陽性藥物水薊素干預的兩組大鼠介于正常大鼠和模型大鼠之在一定程度上說明四逆散具有抗肝損傷的作用。從1中也可以看出,與模型組相比,四逆散組大鼠體潛在標志物的水平達到顯著差異的水平,且有向常大鼠恢復的趨勢,說明血清中可能與肝損傷相的生物標志物在四逆散的作用下趨于正常,體內關的代謝紊亂得到了調整。另外,通過t檢驗發(fā)現(xiàn)正常對照組相比,四逆散組大鼠血清中苯丙氨酸、氨酸、GCDCA代謝物的水平均顯著升高(P<0.05);溶血磷脂酰膽堿類物質LPC16∶0、LPC18∶0、LPC18∶1、LPC16∶1、LPC20∶4和LPC22∶6六種代謝物的水平均顯著降低(P<0.05),說明四逆散組大鼠標志物的水平還沒有完全恢復到正常,這可能是由于用藥時間較短、用藥量較少造成的。但是通過以上綜合分析發(fā)現(xiàn)四逆散組標志物的水平有向正常大鼠恢復的趨勢。4逆散對ccl4致肝損傷大鼠血清膽汁酸代謝的影響4.1氨基酸代謝本實驗中肝損傷模型大鼠血清中苯丙氨酸和色氨酸濃度明顯升高,預示著CCl4致肝損傷模型與氨基酸代謝紊亂密切相關。苯丙氨酸與色氨酸都是人體所必需的芳香族氨基酸,在正常情況下,作為氨基酸合成機體組織細胞各種蛋白,色氨酸還參與調節(jié)蛋白質的合成。當發(fā)生肝損傷或病變時,由于肝功能出現(xiàn)障礙,肝細胞內氨基酸代謝降低,同時也會導致血中芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)濃度升高,甚至會從尿中丟失,同時本身對氨基酸的攝取能力降低。與模型組相比,四逆散組大鼠體內苯丙氨酸和色氨酸水平顯著降低,說明四逆散可以通過調節(jié)氨基酸代謝干預肝損傷。4.2膽汁酸代謝、脂代謝模型組大鼠血清中GCDCA濃度明顯高于正常組,提示CCl4致肝損傷模型大鼠體內膽汁酸代謝受到干擾,從而引起脂代謝功能障礙。GCDCA為結合型膽汁酸,由甘氨酸和鵝脫氧膽酸結合而成,在肝損傷模型大鼠血清中,由于肝功能損傷,血液中膽紅素累積,肝細胞合成初級膽汁酸增加,再與甘氨酸結合,促進了GCDCA的排出量,經過肝腸循環(huán),GCDCA重吸收量增加,使得其在血液中檢測到的量也增加。因此,肝臟損傷越嚴重,其在血清中含量也越高。與模型組相比,四逆散組大鼠體內GCDCA水平顯著降低,提示四逆散可以通過調節(jié)膽汁酸代謝,產生降脂效果,干預肝損傷。4.3氧化-抗氧化作用平衡LPC是一類炎癥因子,毫摩爾濃度的LPC就有著聚集單核細胞和促使巨噬細胞內炎癥細胞因子產生的作用。當發(fā)生肝損傷時,重要的免疫細胞如單核細胞和巨噬細胞以及樹狀細胞均會表現(xiàn)出細胞因子受體的表達受到抑制,細胞因子的量隨著肝損傷程度的增加而減少,進一步引起肝臟的合成、代謝、轉化功能下降,形成了惡性循環(huán)。模型組大鼠血清中的LPC類物質均降低,說明大鼠體內處于嚴重的免疫抑制狀態(tài)。研究表明,四逆散具有抑制脂質過氧化反應損傷、提高清除自由基酶的活性及增強肝細胞抗氧化損傷的能力。與模型組相比,四逆散組大鼠體內LPC水平均顯著升高,提示四逆散可以通過調節(jié)氧化-抗氧化作用平衡,產生降脂效果,從而起到抗肝損傷的作用。以上代謝途徑是相互聯(lián)系的,例如,GCDCA的前體為膽固醇,在體內主要與脂類代謝有關,對油脂消化和脂溶性維生素的吸收有重要作用。膽固醇與卵磷脂可生化反應生成膽固醇脂和溶血磷脂。在肝細胞損傷時,膽固醇脂的合成降低;由于缺氧或氧化磷酸化障礙,致使ATP和CDP-膽堿的形成不足,造成磷脂及極低密度脂蛋白(VLDL)的合成障礙,導致肝內脂肪向體循環(huán)的釋放不足,促使肝細胞中甘油三酯的堆積,磷脂酰膽堿顯著減少,結合型膽汁酸含量增高。本實驗的結果顯示模型組LPC含量顯著減少,GCDCA含量顯著增高,與文獻結果相符。脂代謝、膽汁酸代謝以及體內氧化-抗氧化作用平衡相互聯(lián)系,相互作用。四逆散通過調節(jié)這些代謝途徑發(fā)揮藥效,充分體現(xiàn)了中藥復方“多途徑”、“多層次”、“多靶點”的整體作用的特點。ccl4在生物樣品前處理方法上的應用本文鑒定出9個與CCl4誘導的急性肝損傷相關的潛在生物標志物,包括氨基酸類、膽汁酸類、溶血磷脂酰膽堿類,文獻采用快速分離液相色譜-串