蔗糖合成過程中關(guān)鍵酶基因調(diào)控的研究進(jìn)展

蔗糖合成過程中關(guān)鍵酶基因調(diào)控的研究進(jìn)展

甘蔗生長在亞熱帶和亞熱帶。它是一種古老的光源植物cs，主要用于糖生產(chǎn)。上個世紀(jì)，與其它作物一樣，甘蔗中蔗糖含量的提高主要通過常規(guī)育種調(diào)節(jié)有機(jī)碳的分配實現(xiàn)的。Moore等(1997)將甘蔗產(chǎn)量和蔗糖含量的增加歸結(jié)為源庫關(guān)系的協(xié)調(diào)。50年來，在保持甘蔗抗病性和糖品質(zhì)特定的情況下，澳大利亞通過品種改良使得蔗糖產(chǎn)量每年增加1%～1.5%。但其增加的比例與其它主要作物如玉米、水稻和小麥相比仍較低(Moore1989)，主要原因是甘蔗的遺傳基礎(chǔ)狹窄，必然限制常規(guī)育種中莖中蔗糖含量的提高。Moore(1995)曾對甘蔗生理生化的研究情況作過闡述，現(xiàn)在人們采用的遺傳操作方法，其最直接的目的是企圖增強(qiáng)光合同化產(chǎn)物向甘蔗莖中蔗糖的轉(zhuǎn)化。這對于農(nóng)學(xué)家和環(huán)境學(xué)家來說，很有參考價值。Moore等(1997)根據(jù)理論上甘蔗莖能給蔗糖含量提供的物理容量作出蔗糖可占甘蔗鮮重25%以上的估計，這一估計與Bull和Glaszion(1963)的推斷是一致的，而目前甘蔗中蔗糖的含量約為理論值的一半。由此可見，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增加甘蔗的蔗糖產(chǎn)量具有相當(dāng)大的潛力。通過對蔗糖代謝限速途徑的基因調(diào)控來提高現(xiàn)有優(yōu)良品種的蔗糖含量已經(jīng)提上日程。目前，蔗糖合成過程中關(guān)鍵酶的基因調(diào)控的研究已經(jīng)有了重大的進(jìn)展，在模式植物中已經(jīng)可以通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶的作用來調(diào)控植物的代謝途徑。近年來，甘蔗中編碼蔗糖代謝與糖運輸?shù)拇罅棵富蛞训玫借b定(Zhu等2000;Carson和Botha2002;Carson等2002;Grivet和Arruda2002;Casu等2003)。根據(jù)這些酶的功能定位和活性分析，人們可對糖運輸并貯藏到庫的途徑建立一個模型，從而為進(jìn)一步提高甘蔗蔗糖含量提供參考。1合成淀粉和蔗糖蔗糖是光合作用的主要終產(chǎn)物之一，光合碳代謝形成的磷酸丙糖的去向直接決定了有機(jī)碳的分配。磷酸丙糖或者繼續(xù)參與卡爾文循環(huán)的運轉(zhuǎn)；或者滯留在葉綠體內(nèi)，并在一系列酶作用下合成淀粉；或者通過位于葉綠體被膜上的磷酸丙糖轉(zhuǎn)運器(triosephosphatetranslocator,TPT)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，再在一系列酶的作用下合成蔗糖。合成的蔗糖或者臨時貯藏于液泡內(nèi)，或者輸出光合細(xì)胞，經(jīng)韌皮部裝載通過長距離運輸運向庫細(xì)胞。1.1蔗糖合成途徑的變化光合細(xì)胞中參與蔗糖生物合成的所有酶都位于細(xì)胞質(zhì)中，據(jù)此認(rèn)為，蔗糖合成是在甘蔗的葉肉細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的。磷酸丙糖從葉綠體中運出之后，在細(xì)胞質(zhì)中參與氨基酸、脂肪酸和蔗糖的合成反應(yīng)。在大多數(shù)植物中蔗糖是碳水同化產(chǎn)物運輸?shù)闹饕问健Ｔ谡崽呛铣蛇^程中，主要限速酶有細(xì)胞質(zhì)型果糖-1,6-二磷酸酯酶(FBPase)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)。FBPase催化果糖1,6-二磷酸分解為6-磷酸果糖(F6P)和無機(jī)磷酸，F(xiàn)BPase與磷酸果糖激酶(PFK)及焦磷酸:果糖-1,6-二磷酸轉(zhuǎn)移酶(PFP)共同作用，調(diào)控蔗糖合成途徑中的一個必需單糖的生成(Huber和Huber1992)。在甘蔗葉片中已經(jīng)鑒定出對蔗糖合成有限速作用的SPS是一種關(guān)鍵目標(biāo)酶(Stitt和Quick1989)。SPS催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)與F6P結(jié)合形成磷酸蔗糖。這是蔗糖合成的倒數(shù)第2步反應(yīng)，且不可逆的，接著蔗糖磷酸酯酶催化最后一步反應(yīng)，生成蔗糖。因此，在細(xì)胞質(zhì)中增加蔗糖的合成途徑之一就是通過打破這些反應(yīng)的平衡，使反應(yīng)向增加蔗糖合成的方向移動。其合成途徑如圖1。1.2sps活性的調(diào)控在大多數(shù)甘蔗品種中，葉中SPS活性與蔗糖含量密切相關(guān)(Grof等1998)。Glasziou和Gayler(1972)建立的甘蔗蔗糖積累模型，直到最近才被接受。葉片光合作用產(chǎn)生的蔗糖通過質(zhì)子-蔗糖共運載體在韌皮部裝載，隨單糖的運輸穿過質(zhì)膜，卸載到莖的薄壁組織。其中一部分蔗糖為細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶降解，而后在細(xì)胞中重新合成并貯藏在液泡中。但在事實上也有韌皮部共質(zhì)體運輸?shù)?Jacobsen等1992;Welbaum等1992)。在甘蔗細(xì)胞培養(yǎng)中，蔗糖在質(zhì)外體、細(xì)胞質(zhì)和液泡之間的快速轉(zhuǎn)化有助于甘蔗迅速適應(yīng)環(huán)境的改變，同時也說明共質(zhì)體運輸是存在的(Moore1995)。Zhu等(1997)證實，組成型表達(dá)啟動子泛素可以提高SPS活性及其在莖中的表達(dá)。甘蔗莖中蔗糖的含量依賴于SPS的活性，即SPS活性越高，蔗糖積累得越多(劉凌霄等2005)。Huber和Huber(1992)也曾指出SPS活性與淀粉積累呈負(fù)相關(guān)，而與蔗糖積累呈正相關(guān)，SPS的活性直接影響光合產(chǎn)物在淀粉與蔗糖之間的分配。Huber和Huber(1996)的研究支持這一觀點。因此認(rèn)為，SPS可能是蔗糖合成途徑中的一個重要控制點，它的活性反映生物合成途徑的能力。陳俊偉等(2004)提出，SPS在蔗糖積累型庫組織中起作用，許多果實成熟過程中蔗糖積累均與SPS活性升高密切相關(guān)。SPS參與調(diào)控蔗糖長距離運輸與庫組織的蔗糖代謝。此外，Botha和Black(2000)也證明在甘蔗‘Nco376’的莖中SPS活性與蔗糖濃度密切相關(guān)。Glasziou和Gayler(1972)根據(jù)高糖和低糖型甘蔗品種(母本S.officinaramLouisianaPurple和父本S.robustumMolokai5829)雜交后代的結(jié)果，推斷可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(SAI)活性達(dá)到一定的限度時可限制莖中蔗糖積累。Moore(1995)建立的甘蔗蔗糖合成與降解的動態(tài)循環(huán)模型也得到部分證實，即隨著甘蔗成熟度增加的SPS/SAI比例的變化可顯示出蔗糖積累動態(tài)過程和最終含量。因此，為了得到高糖型品種的蔗糖存貯水平，激發(fā)SPS的高活性是非常必要的。2蔗糖運輸機(jī)制甘蔗葉中由光合作用形成的蔗糖運輸?shù)巾g皮部進(jìn)行裝載，然后進(jìn)入篩管進(jìn)行長距離運輸，最后經(jīng)韌皮部卸出后進(jìn)入甘蔗莖中的薄壁細(xì)胞貯藏。在整個運輸過程中，其中一部分蔗糖在甘蔗的生長部位水解成果糖和葡萄糖，供甘蔗生長之需；另一部分蔗糖則在甘蔗的貯藏薄壁組織的液泡中積累。蔗糖從甘蔗葉肉細(xì)胞合成到薄壁組織中貯藏需經(jīng)歷以下幾個復(fù)雜步驟：(1)蔗糖運送到韌皮部裝載區(qū)。在甘蔗中，韌皮部的傳導(dǎo)細(xì)胞與葉片中的其它細(xì)胞不是通過胞間連絲相連，因此，韌皮部裝載途徑僅發(fā)生在甘蔗葉片的質(zhì)外體中。在甘蔗葉肉細(xì)胞的光合組織中合成的蔗糖，經(jīng)質(zhì)膜上的質(zhì)子-蔗糖共運載體進(jìn)入質(zhì)外體，運至伴胞；質(zhì)外體的質(zhì)子-蔗糖共運載體在H+梯度驅(qū)動下，進(jìn)入伴胞，然后經(jīng)胞間連絲進(jìn)入篩管。在源組織中，蔗糖裝載引起水的流入，并且引起細(xì)胞膨脹，驅(qū)動源組織中蔗糖的運輸。反之，韌皮部蔗糖的去除引起韌皮部庫組織滲透壓的減小(VanBel2003;Rae等2005a)。蔗糖運載體繼續(xù)在韌皮部表達(dá)，而且還可能促使質(zhì)外體滲漏中丟失的蔗糖得到恢復(fù)?，F(xiàn)已證實，位于膜上的蔗糖運載體在介導(dǎo)蔗糖向韌皮部裝載的運輸過程中起作用(Lalonde等2003)。(2)蔗糖在篩管中長距離運輸。蔗糖在篩管內(nèi)運輸是一種集體流，它是由源庫兩側(cè)篩管-半胞復(fù)合體(SE-CC)內(nèi)滲透作用所形成的壓力梯度所驅(qū)動的。而壓力梯度的形成則是由于源端蔗糖不斷向SE-CC復(fù)合體進(jìn)行裝載，庫端蔗糖不斷從SE-CC復(fù)合體卸出，以及韌皮部和木質(zhì)部之間水分的不斷再循環(huán)所致(Vaughn等2002)。即光合細(xì)胞制造的蔗糖在能量的驅(qū)動下主動裝載進(jìn)入篩管分子，從而降低源端篩管內(nèi)的水勢，而篩管分子又從鄰近的木質(zhì)部吸收水分，以引起篩管膨壓的增加；與此同時，庫端篩管中的蔗糖不斷卸出并進(jìn)入周圍的庫細(xì)胞，這樣就使篩管內(nèi)水勢提高，水分可流向鄰近的木質(zhì)部，從而引起庫端篩管內(nèi)膨壓的降低(Moore和Cosgrove1991)。因此，只要源端蔗糖的韌皮部裝載和庫端蔗糖的卸出過程不斷進(jìn)行，源庫間就能維持一定的壓力梯度，在此梯度下，蔗糖可源源不斷地由源端向庫端運輸。(3)蔗糖從韌皮部卸出。甘蔗中蔗糖從韌皮部運輸?shù)劫A藏薄壁組織受貯藏組織結(jié)構(gòu)的影響。甘蔗莖的維管束為一層在發(fā)育中木質(zhì)化和木栓化的厚壁細(xì)胞所包圍(Moore和Cosgrove1991)。這一層厚壁細(xì)胞可在蔗糖質(zhì)外體運輸過程中形成一個屏障。這樣僅通過質(zhì)外體途徑并不能使蔗糖從韌皮部運向薄壁細(xì)胞。大量胞間連絲的存在表明維管束中所有細(xì)胞都是共質(zhì)相連的。而共質(zhì)體染色示蹤劑可以從韌皮部運輸?shù)骄S管薄壁細(xì)胞，然后通過厚壁細(xì)胞進(jìn)入維管束周圍薄壁細(xì)胞的第1層(Rae等2005a)。但為了維持蔗糖流量梯度，蔗糖可能是從共質(zhì)體運向質(zhì)外體或液泡的，貯藏薄壁組織的質(zhì)外體中發(fā)現(xiàn)高濃度蔗糖，表明蔗糖輸出到維管束周圍厚壁細(xì)胞外的質(zhì)外體機(jī)制是存在的(Welbaum等1992)。蔗糖運載體在韌皮部裝載途徑中的作用已得到證實，但是否在卸載途徑和韌皮部后途徑中起作用還不清楚。有證據(jù)顯示，甘蔗中質(zhì)子的活化潛能能讓其穿過質(zhì)膜，促使蔗糖、葡萄糖和果糖通過質(zhì)子-蔗糖同向運輸系統(tǒng)運輸?shù)角o中薄壁細(xì)胞(Moore等1997)。編碼葡萄糖運載體的基因已經(jīng)從甘蔗中分離到(Moore1995)，但是它們是否定位在甘蔗莖中薄壁組織的質(zhì)膜中仍在探討中。Chiou和Bush(1996)根據(jù)易化超家族(MFS)基因的第6個和第12個跨膜保守區(qū)設(shè)計的簡便引物從甜菜中鑒定出一個公認(rèn)的蔗糖運載蛋白，并能在酵母和煙草中表達(dá)。采用蔗糖梯度和差速離心法分析合成的蛋白質(zhì)與液泡膜標(biāo)記(marker)共遷移技術(shù)已在甘蔗莖中鑒定出一個蔗糖運載體，命名為ShSUT1，定位在莖中維管束周圍的組織中(Rae等2005b)。這個運載體可能在蔗糖從質(zhì)外體向共質(zhì)體的逆過程中起作用，也可能涉及貯藏組織中質(zhì)外體的蔗糖流量，但此問題還需進(jìn)一步研究。(4)蔗糖輸出到質(zhì)外體。卸載途徑中包括一個質(zhì)外體運輸，即在質(zhì)外體中積累的蔗糖可能轉(zhuǎn)化為其它形式的糖。正在發(fā)育的大麥種子，從母本組織中卸載的蔗糖可為轉(zhuǎn)化酶降解，并且，蔗糖運載體和已糖運載體在胚乳表面的傳導(dǎo)細(xì)胞中表達(dá)以利于吸收。這是從轉(zhuǎn)化酶和運載體的協(xié)同表達(dá)作為信號調(diào)控已糖與蔗糖的比例的實驗中得到證實(Weschke等2003)。胞外轉(zhuǎn)化酶的活性在甘蔗莖組織中已經(jīng)檢測到，它控制質(zhì)外體中蔗糖向已糖轉(zhuǎn)化的比例(Glasziou和Gayler1972)。這表明轉(zhuǎn)化酶活性可維持一定的蔗糖梯度以推動連續(xù)卸載。但有人檢測，轉(zhuǎn)化酶活性與已糖含量是隨著甘蔗莖節(jié)間成熟度增加而下降的(Rose和Botha2000;Albertson等2001)。這表明這個途徑可能在幼嫩的節(jié)間更有意義，在幼嫩的組織中以葡萄糖作為纖維合成和呼吸作用的供體可能比成熟組織高。甘蔗薄壁細(xì)胞吸收的糖轉(zhuǎn)化為蔗糖或已糖或是兩者都有這一問題還未肯定。最近，在甘蔗中鑒定出1個在薄壁細(xì)胞表達(dá)的己糖運載體，它所吸收的葡萄糖和果糖能為胞外酶重新合成蔗糖(Whittaker和Botha1997)。其中的細(xì)節(jié)及其原因還不太清楚。但蔗糖運輸途徑中成員的定位為支持或反駁這個假說提供了依據(jù)。例如，這個途徑需要薄壁細(xì)胞中的已糖運載體和蔗糖合成酶或蔗糖磷酸合成酶共同表達(dá)，而且編碼這些代謝酶的基因在甘蔗中已得到分離鑒定，這可能會成為闡述蔗糖運輸途徑的一個證據(jù)。(5)蔗糖經(jīng)韌皮部卸出后進(jìn)入貯藏薄壁細(xì)胞。甘蔗莖中薄壁細(xì)胞的液泡占很大比例，貯藏的蔗糖大部分位于液泡內(nèi)。進(jìn)入液泡中的蔗糖有助于維持細(xì)胞質(zhì)的低濃度，這可為蔗糖向薄壁細(xì)胞的連續(xù)運輸提供驅(qū)動力，或從質(zhì)外體攝取，或通過共質(zhì)體相連(Casu等2003)。但液泡和細(xì)胞質(zhì)中蔗糖的相對濃度是多少，在甘蔗組織中還未測定。已經(jīng)知道，其它物種中的質(zhì)膜H+-ATPase和焦磷酸酶活性在液泡內(nèi)可維持一個低的pH值，并可為依賴濃度梯度穿過質(zhì)膜的主動運輸提供能量(Maeshima2001)。3甘蔗莖中的葡萄糖的分解和再合成蔗糖可為蔗糖轉(zhuǎn)化酶的3種異構(gòu)體和蔗糖合成酶(sucrosesynthase,SS)分解，同時，又可為SPS的異構(gòu)體和SS重新合成。3.1蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因家族在甘蔗中的應(yīng)用蔗糖轉(zhuǎn)化酶(invertase,Ivr)又稱β-呋喃果糖酶或蔗糖酶，催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖。根據(jù)亞細(xì)胞位置、可溶性和最適pH值的不同，蔗糖轉(zhuǎn)化酶分為酸性轉(zhuǎn)化酶(acidinvertase,AI)和中性轉(zhuǎn)化酶(neutralinvertase,NI)。AI的最適pH值范圍為4.5～5.0，并且以可溶性的和不溶性的2種狀態(tài)存在(Sturm1999)。近年來，從分子水平上研究的結(jié)果表明，這2種形態(tài)的蔗糖轉(zhuǎn)化酶是由2類完全不同的基因家族編碼的。NI的最適pH值在7.0左右，大多認(rèn)為是一種胞質(zhì)酶?？扇苄訟I主要存在于液泡中。液泡型酸性轉(zhuǎn)化酶(VAI)的活性在未成熟的和生長旺盛的莖組織中很高，并且隨著莖成熟度的增加而下降(Lingle1999)。VAI的這種變化不僅表明細(xì)胞伸長過程中需要將蔗糖轉(zhuǎn)化為單糖，同時也表明細(xì)胞增殖過程中也需要蔗糖作為代謝底物。由此可見，在植物生長過程中通過VAI調(diào)控蔗糖積累非常重要。此外，VAI對逆境條件下維持細(xì)胞的正常功能也起一定的作用，例如非季節(jié)性的降雨、高溫、延遲收獲等都可導(dǎo)致蔗糖的重新分配，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化(Zhu等1997)。不溶性AI(也稱為細(xì)胞壁型轉(zhuǎn)化酶，CWI)定位于質(zhì)外體，以離子鍵的形式與細(xì)胞壁結(jié)合。Vorster和Botha(1998)提出，甘蔗中存在CWI的可溶性形式。蔗糖從甘蔗莖的韌皮部卸出后進(jìn)入質(zhì)外體中水解為葡萄糖和果糖，以維持韌皮部和質(zhì)外體的蔗糖濃度梯度，因此認(rèn)為CWI是蔗糖從韌皮部卸出的驅(qū)動力(Roitsch和González2004)。目前蔗糖轉(zhuǎn)化酶的基因已在甘蔗中得到克隆(Sturm1999)。同時，AI調(diào)控源-庫關(guān)系所起的作用已經(jīng)在C3模式植物如煙草、擬南芥、馬鈴薯和番茄中得到證明。3.2ss活性、甘蔗和蔗糖的相互作用SS是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的可溶性酶，有些不溶性的SS附著在細(xì)胞膜上；在植物生長發(fā)育過程中，SS既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，但主要起分解作用(Sch?fer等2005)，催化可逆反應(yīng)如下:SPS和SS分別驅(qū)動蔗糖的合成或降解反應(yīng)的熱力學(xué)已非常明確，SS既可降解蔗糖又可合成蔗糖，因此，它的功能變得更加復(fù)雜。SS在甘蔗中的重要性不能忽視。它對庫組織中蔗糖的卸出途徑起作用(Martin等1993)，同時也可作為“庫強(qiáng)”的一個指示器(Farrar1993)。蔗糖降