四逆湯甘草苷、甘草酸含量的比較

四逆湯甘草苷、甘草酸含量的比較

四逆湯是張仲景“傷寒論”治療少陰寒虛證的主要方針。四逆湯由炮附子、干姜、炙甘草(3∶2∶3)組成,是中醫(yī)回陽(yáng)救逆的經(jīng)典名方,具有強(qiáng)心、抗休克作用?，F(xiàn)代臨床觀察和藥理研究表明,四逆湯能保護(hù)心肌、改善心功能、防止缺血-再灌注的損傷,特別是對(duì)冠心病、心絞痛患者的對(duì)癥治療很有效果。文獻(xiàn)報(bào)道附子生物堿是四逆湯有效成分組合中的關(guān)鍵因素,但干姜揮發(fā)油和甘草酸粗品也是組方中不可或缺的因素。因此,為考察不同提取方法制備的四逆湯中有效成分的提取率,本文以炙甘草中黃酮類成分甘草苷、甘草酸為指標(biāo)成分之一,測(cè)定其含量;對(duì)傳統(tǒng)水提法、藥典收錄的水提醇沉法及針對(duì)各單味藥有效成分分別提取后合并制備的四逆湯中甘草苷、甘草酸的含量進(jìn)行了測(cè)定。1藥材、藥品與材料Agilent1200型高效液相色譜儀(包括脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫箱、DAD檢測(cè)器),ChemStation色譜工作站,KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器(群山市超聲儀器有限公司),國(guó)華恒溫振蕩器,AF240型電子天平(瑞士梅特勒公司),RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。藥材購(gòu)于山東濟(jì)南建聯(lián)藥店,均經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為道地藥材。黑附子(毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的炮制加工品)、干姜(姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的干燥根莖)(產(chǎn)地四川),炙甘草(豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的炮制加工品,產(chǎn)地內(nèi)蒙古),甘草苷對(duì)照品和甘草酸銨對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào)分別為A0040和A0039,含量均>98%),實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水,色譜用水為娃哈哈純凈水,乙腈、甲醇、磷酸為色譜純,其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1流動(dòng)相梯度a-乙腈-磷酸水體系內(nèi)標(biāo)物柱相梯度如表1AglientZorbaxSB-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),柱溫25℃,檢測(cè)波長(zhǎng)237nm,流速1.0mL·min-1,進(jìn)樣量10μL,流動(dòng)相A-乙腈,B-0.05%磷酸水,梯度洗脫,梯度程序見(jiàn)表1。理論塔板數(shù)按甘草苷峰計(jì)算不低于5000,各待測(cè)組分峰與相鄰成分峰的分離度均符合規(guī)定。2.2溶液的制備2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備精密稱取甘草苷和甘草酸銨對(duì)照品適量,分別加70%乙醇制成每1mL中含甘草苷1.05mg和甘草酸銨1.18mg甘草酸銨的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述儲(chǔ)備液適量于量瓶中,用70%乙醇稀釋至所需質(zhì)量濃度(甘草苷0.0525g·L-1,甘草酸銨0.059g·L-1),即得2種組分的對(duì)照品溶液。2.2.2試驗(yàn)溶液的制備2.2.2.制備流程樣品溶液取藥材粗粉(過(guò)20目篩)黑附子12g,炙甘草12g,干姜8g,加8倍量水浸泡1h,煎煮30min,過(guò)濾,殘?jiān)?倍量水煎煮20min,過(guò)濾,濾液合并,濃縮至60mL,冷藏備用。2.2.2.提取液1h取藥材粗粉(過(guò)20目篩)黑附子12g,炙甘草12g,加8倍量水加熱回流提取2h,過(guò)濾,殘?jiān)?倍量水加熱回流提取1h,過(guò)濾,濾液合并。取藥材粗粉(過(guò)20目篩)干姜粉末8g,置于250mL燒瓶中,加12倍量水,水蒸氣蒸餾提取5h,揮發(fā)油和蒸餾后水溶液備用,殘?jiān)?倍量水煎煮1h,過(guò)濾,煎液合并再與附子、炙甘草提取液合并,濃縮至60mL,加無(wú)水乙醇180mL,靜置10h后離心,得上清液,將其旋蒸濃縮至60mL,冷藏備用。2.2.2.黃酮類、揮發(fā)油的提取黑附子中生物堿的提取:藥材粗粉(過(guò)20目篩)12g,精密稱定,24倍量pH1.0酸水提取2次,振蕩浸提,每次1.5h,過(guò)濾,合并濾液并濃縮至約30mL。炙甘草中黃酮類的提取:藥材粗粉(過(guò)20目篩)12g,精密稱定,20倍量0.3%氨水-60%乙醇加熱回流提取4次,每次2h,過(guò)濾,合并濾液并濃縮至約30mL。干姜中揮發(fā)油的提取:藥材粗粉(過(guò)20目篩)8g,精密稱定,14倍量水,浸泡3h后水蒸氣蒸餾提取5h,揮發(fā)油和蒸餾后水溶液備用,殘?jiān)?倍量水煎煮1h,煎液與上次蒸餾后水溶液合并,濃縮至約20mL。將各單味藥提取液轉(zhuǎn)移合并為80mL,冷藏備用。2.2.2.靜置甘草藥材量的測(cè)定取傳統(tǒng)提取液2mL,藥典提取液2mL,各單味藥分提合并液2.67mL(折合炙甘草藥材量0.4g)分別置于25mL量瓶中,加70%乙醇定容至刻度,混勻靜置過(guò)夜。過(guò)濾,取續(xù)濾液,經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò),即得復(fù)方供試品溶液1~3。2.3方法的線性回歸方程分別取2.2.1項(xiàng)下甘草苷、甘草酸銨混合對(duì)照品溶液1,2,4,6,8,10μL,甘草苷、甘草酸銨對(duì)照品溶液1,2,5,10,15,20μL,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄峰面積。以對(duì)照品量X對(duì)色譜峰面積Y進(jìn)行線性回歸,結(jié)果甘草苷和甘草酸銨的線性回歸方程分別為Y=2637084.94X+8.81,(r=0.9996);Y=686194.11X-2.26(r=1.0000)。線性范圍分別為0.0525~0.525μg和0.059~1.180μg。2.4進(jìn)樣精密度試驗(yàn)取2.2.1項(xiàng)下甘草苷和甘草酸銨對(duì)照品溶液10μL,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)得甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.2%,0.1%,表明精密度良好。2.5外標(biāo)法確定甘草苷和甘草酸銨含量取同一批號(hào)的藥材6份(黑附子3g,炙甘草3g,干姜2g)精密稱取,按2.2.2.1項(xiàng)下方法制備傳統(tǒng)復(fù)方提取液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,按外標(biāo)法分別計(jì)算甘草苷和甘草酸銨的含量,測(cè)得含量分別為2.543,1.902mg·g-1,RSD分別為0.3%,0.5%(n=5)。2.6加樣穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批號(hào)的藥材6份(黑附子3g,炙甘草3g,干姜2g)精密稱取,按2.2.2.1項(xiàng)下方法制備傳統(tǒng)復(fù)方提取液,于室溫下在同一天不同時(shí)間點(diǎn)(0,2,4,8,12h)分別進(jìn)樣10μL,并于12h進(jìn)樣后置4℃冰箱保存,于24h后取出進(jìn)樣10μL,結(jié)果甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.8%,0.9%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.7加樣回收率和rsd取已知含量的同一批藥材6份,每份黑附子0.2g,炙甘草0.2g,干姜0.13g(含甘草苷、甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.545,1.860mg·g-1),分別加入甘草苷對(duì)照品溶液1mL(0.525g·L-1),甘草酸銨對(duì)照品溶液700μL(取1.18g·L-1母液稀釋2倍,0.590g·L-1),按2.2.2.1項(xiàng)下方法制備傳統(tǒng)復(fù)方提取液,同一色譜條件進(jìn)樣10μL,按外標(biāo)法測(cè)定其含量,計(jì)算平均加樣回收率和RSD。結(jié)果見(jiàn)表2。2.8復(fù)方供試品溶液的制備取四逆湯各藥材粗粉適量,按2.2.2項(xiàng)下方法制備復(fù)方供試品溶液1~3,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。按外標(biāo)法分別計(jì)算供試品溶液中甘草苷和甘草酸銨的含量(mg·g-1)。結(jié)果見(jiàn)圖1和表3。3揮發(fā)油的提取本實(shí)驗(yàn)針對(duì)傳統(tǒng)復(fù)方提取法及藥典提取法進(jìn)行分析。傳統(tǒng)法多為群藥合煎,存在有效成分提取率不高,毒性成分減毒機(jī)制不明,揮發(fā)性成分散失等不足;藥典收錄的四逆湯合劑的制備方法為水提醇沉(揮發(fā)油單提后合并),會(huì)造成成分損失。經(jīng)檢索相關(guān)文獻(xiàn),根據(jù)各單味藥所含成分的化學(xué)性質(zhì),對(duì)黑附子中生物堿采用酸提取,炙甘草皂苷類成分采用氨醇提取,干姜揮發(fā)油單獨(dú)提取后、保留水提液,將各單藥提