尿石清合劑質量標準研究 中藥學專業(yè)

PAGEIPAGEI 尿石清合劑質量標準研究目錄摘要 Ⅰ-Ⅱ1前言 12材料與儀器 32.1儀器 32.2材料 32.3供試品 33薄層色譜鑒別 33.1車前子薄層鑒別 33.2川牛膝薄層鑒別 53.3梔子薄層鑒別 63.4甘草薄層鑒別 73.5石韋薄層鑒別 93.6廣金錢草薄層鑒別 104梔子苷含量測定 114.1色譜條件 114.2進樣溶液的制備 124.3方法學考察 124.4樣品中梔子苷的含量測定 165討論 175.1薄層鑒別研究因素變量討論 175.2車前子薄層鑒別研究結果討論 175.3川牛膝薄層鑒別研究結果討論 185.4梔子、甘草薄層鑒別研究結果討論 195.5石韋薄層鑒別研究結果討論 19 5.6廣金錢草薄層鑒別研究結果討論 205.7梔子苷含量測定研究結果討論 206結論 21綜述 25致謝 34PAGEII PAGEII尿石清合劑質量標準研究摘要：目的建立尿石清合劑的質量標準。方法采用薄層鑒別法對制劑中的車前子、川牛膝、石韋、廣金錢草、梔子、甘草這六味藥進行定性鑒別；用高效液相色譜法對其主藥梔子中的梔子苷進行含量測定。結果尿石清合劑的車前子、川牛膝、石韋、廣金錢草、梔子、甘草薄層色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾；樣品溶液中檢測出梔子苷的特征性色譜峰，分離度較好，且陰性樣品溶液中無該特征性色譜峰，梔子苷進樣量在0.00497~0.07956mg/mL范圍內與峰面積積分值線性關系良好(r=0.9997)。平均加樣回收率為103.6%，(RSD=1.59%)。結論研究的質量標準方法簡便可行、準確，可用于尿石清合劑的質量控制指標。關鍵詞：尿石清合劑；薄層色譜法；高效液相法；梔子苷；質量標準；ResearchonQualityStandardofNiaoShiQingMixtureAbstract：Objective:ToestablishthestandardsforqualityofNiaoShiQing.Methods：Plantagoasiatica,CyathulaofficinalisKuan,FoliumPyrrosiae,Desmodiumstyracifolium,GlycyrrhizaUralensisandGardeniajasminoidesEillswereidentifiedbythinlayerchromatography.HighperformanceliquidchromatographyappliedforthedeterminationofGeniposideinGlycyrrhizaUralensisinNiaoShiQingMixture.Results:ThechromatogramsofPlantagoasiatica,CyathulaofficinalisKuan,FoliumPyrrosiae,Desmodiumstyracifolium,GlycyrrhizaUralensisandGardeniajasminoidesEillsobtainedthroughTLCpresentedthespotsofthesamecolorswiththoseinthecorrespondingplacesinthechromatogramsofthecontrols.Geniposidewaslinearwithpeakareascorewhenitssamplesizewaswithintherangeof0.0497~0.07956mg/ml(r=0.9997),theaveragerecoverywas103.6%(RSD=1.59%).Conclusion：theoperationofthismethodiseasywithhighaccuracy,whichcanbeusedforthequalitativeidentificationofthispreparation.Keywords：NiaoShiQing；TLC；HPLC；Geniposide；QualityStandard；PAGEPAGE5PAGE2PAGE21前言尿石清合劑是中山市中醫(yī)院新研發(fā)的制劑，為棕色至棕褐色液體；氣微，味甜、微苦；放置有少量的沉淀。尿石清合劑由車前子、川牛膝、滑石、梔子、石韋、甘草、海金沙、廣金錢草、冬葵果等九味藥組成。方劑中廣金錢草味甘、咸，微寒，利濕退毒，利尿通淋排石，多用于石淋治療。車前子、滑石、海金沙、石韋均為利尿通淋藥。車前子甘寒，利尿通淋，滑石甘、淡寒，可清熱開竅通淋，收濕斂瘡，二者常配伍使用，治療濕熱淋癥的常用之品。海金沙味甘、咸，性寒，石韋味苦甘，性微寒，二者清熱利濕，利尿通淋，另，石韋可涼血止血，尤以血淋澀痛為宜。四藥常配伍使用，以增廣金錢草利尿通淋排石之力。梔子味苦，性寒，善清三焦火邪，又利濕退黃；冬葵果味甘、澀，性涼，味澀收斂，涼血解毒排膿，利尿通淋；川牛膝，味苦、甘、酸，性平，利水通淋，因其苦平下行，可引濕熱瘀濁下泄，即增其清熱之力，又增滑石等利尿通淋藥之力；甘草味甘，性平，益氣補中，緩急止痛，又調和諸藥寒涼之性；以上九味合用，清熱利濕解毒，通淋排石，用于濕熱下注所致的膀胱結石、腎結石、輸尿管結石泌尿系統(tǒng)感染，但因其性較寒涼，虛者慎用。SMP術后加服尿石清合劑可顯著提高腎盂壓力，增加尿量，提高血清Mg2+、SCr、BUN、枸櫞酸含量，降低Ca2+、P、草酸含量，活血生新、通淋排石、行氣止痛、調理氣機、改善微循環(huán)，療效顯著[1]。車前子含有黃酮類化合物，三萜類化合物、揮發(fā)油、多糖成分等[2]。車前子多糖化合物是車前子緩瀉作用的主要成分[3]，且車前子多糖和鈣離子具有很強的結合能力[4]，從而達到通淋的作用；而環(huán)烯醚萜苷類化合物是車前子利尿作用的主要有效成分[5]。廣金錢草含有黃酮類、生物堿類、萜類、甾醇類、酚酸類、揮發(fā)油等化學成分，廣金錢草中的多糖、萜類化合物、黃酮類化合物具有抑制泌尿系結石的形成的作用[6]。川牛膝中含有多糖、甾酮類、皂苷、阿魏酸等多種天然有機化合物，具有調節(jié)血液粘稠度、改善微循環(huán)、增強免疫力等藥理作用[7]；其所含甾酮類為天然植物雌性激素，對泌尿生殖系統(tǒng)疾病有顯著的治療效果[8]。石韋的化學成分主要是三萜類化合物、黃銅類化合物、揮發(fā)油、綠原酸、綠原酸甲酯[9]、芒果苷[10]、異芒果苷[11]等。石韋有抑菌、抗病毒活性、抗炎利尿、增強免疫、護腎等藥理作用[12]。毛坤等[13]研究表明石韋具有顯著的抗泌尿系統(tǒng)結石的作用。甘草的主要有效成分為多糖類、黃酮類、三萜類等。羥基芐基丙二酸是甘草中含量相對較高的化學成分[14]。甘草黃酮、甘草多糖、甘草酸、甘草次酸均有抗腫瘤的藥理作用，甘草有良好的的調節(jié)免疫和抗病毒的功效等功效[15]。梔子主要含有環(huán)烯醚萜類（特征性性成分）、二萜類、三萜類、黃酮類、有機酸酯類、揮發(fā)油類化學成分。梔子中的京平尼苷可以促進大腸蠕動，具有瀉下作用[16]；且對糖尿病大鼠有明顯的降血糖作用[17]。梔子苷是環(huán)烯醚萜類化合物，是梔子中活性最高的成分之一，具有保肝利膽、抗炎、抗血栓和纖溶[18]、瀉下作用[16]等作用，此外梔子苷還具抗流感病毒活性的作用[19]。目前國內關于尿石清合劑的研究只有一篇，主要針對尿石清合劑的臨床應用研究，未見與該合劑相同組方制劑質量標準的研究報道。應用薄層色譜法（TLC），提高產(chǎn)品的可控性及穩(wěn)定性，是當今中藥制劑研究的熱點。目前尿石清合劑質量標準水平均較低，與《藥品注冊管理辦法》中新藥要求還有距離，其質量標準是否科學合理，直接影響制劑產(chǎn)品質量進而影響臨床療效發(fā)揮，因此有必要對制劑質量標準進行系統(tǒng)研究,這對保證制劑質量的穩(wěn)定性，提高制劑產(chǎn)品療效有重要的現(xiàn)實意義。采用薄層色譜鑒別法對制劑處方中廣金錢草、川牛膝、梔子、車前子、石韋、甘草等藥味進行鑒別研究，找到具有專屬性、穩(wěn)定性的TLC鑒別方法。采用HPLC法對方中主要藥味梔子的指標成分梔子苷進行含量測定研究。2材料與儀器2.1儀器KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、JP-300A高速多功能粉碎機、ELECTRONICSCALC、Goodsee-I薄層色譜攝影儀（上海科哲生化科技有限公司）、美國Agilent1100系列高效液相色譜儀；色譜柱：VenusilXBPC18(L)柱(250mmx4．6mm，5μm，AgelaTechnologies)。2.2材料薄層層析硅膠G板（青島海洋化工有限公司，批號：20170718，規(guī)格：100×100mm）；乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲酸、甲苯、甲酸乙酯、冰醋酸、正丁醇、無水乙醇、乙醇（95%）、甲醇均為分析純，蒸餾水，純化水；硫酸溶液、稀鹽酸、中性氧化鋁（100~200目）、薄層層析硅膠（G分析純）、羧甲基纖維素鈉（批號960501）、10硫酸乙醇溶液、2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液、5%三氯化鐵乙醇溶液、1%三氯化鋁乙醇溶液、梔子苷對照品（批號：110749-201316，供含量測定用，含量以97.5%計）：由中國食品藥品檢定研究院所提供；流動相用甲醇為色譜純，水為純化水；甲醇（分析純）2.3供試品尿石清合劑（中山市中醫(yī)院，批號：20170120、20170912、20171031、20171130、20171228）3薄層色譜鑒別3.1車前子薄層鑒別取尿石清合劑10mL，用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次25mL，合并正丁醇提取液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次25mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，加入中性氧化鋁1g（100~200目），拌勻，蒸干，加于中性氧化鋁柱（3g,100~200目，內徑9mm，干法裝柱）上，用80%的甲醇30mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇1mL使溶解，作為供試品液。取不含車前子的其余藥材，制成陰性溶液，取其溶液10mL,同制成供試品溶液法制成不含車前子的陰性對照溶液。另取車前子對照藥材2g，粉碎，加20mL甲醇，超聲30min，過濾，濾液蒸干，殘渣加2mL甲醇溶解，制成對照藥材溶液。分別吸取供試品溶液和陰性對照溶液各6μL以及對照藥材溶液4μL，點于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯－乙醇－甲酸－水（16:3:1:0.8）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以含2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在80~85℃下加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈光（365nm）下檢視。3.1.1不同硅膠G薄層板的考察圖3-1-1手鋪板（T:12℃、RH:25%）圖3-1-2青島海洋化工（T:12℃、RH:25%）3.1.2不同濕度的考察圖3-1-3手鋪板（T:14℃、RH:88%）圖3-1-4手鋪板（T:14℃、RH:32%）3.1.3不同溫度的考察圖3-1-5青島海洋化工（T:14℃、RH:35%）圖3-1-6手鋪板（T:4℃、RH:10%）注：1~3供試品溶液（20171031、20171130、20171228）4對照藥材溶液5陰性對照溶液3.2川牛膝薄層鑒別取樣品10mL，用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加無水乙醇2mL使溶解，作為供試品溶液。取缺川牛膝的陰性溶液10mL同法制得陰性對照溶液。取川牛膝2g，加20mL甲醇，超聲30min，過濾，濾液蒸干，殘渣加2mL甲醇使溶解，作為川牛膝對照藥材溶液。分別吸取供試品溶液、陰性對照溶液和對照藥材溶液各5μL分別點于同一硅膠G板上，以氯仿－丙酮－甲酸（15:1:0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，熱風吹干，置紫外光燈(365nm)下檢視。3.2.1不同溫度的考察圖3-2-1手鋪板（T:4℃、RH:10%）圖3-2-2青島海洋化工（T:19℃、RH:50%）3.2.2不同濕度的考察圖3-2-3手鋪板（T:19℃、RH:88%）圖3-2-4手鋪板（T:19℃、RH:32%）注：1~3供試品溶液（20171031、20171130、20171228）4對照藥材溶液5陰性對照溶液圖21.圖21.具緣紋孔（×400）圖23.具緣紋孔維（×400）圖20.石細胞（×400）圖21.石細胞（×400）3.3梔子薄層鑒別取樣品溶液10mL，加水飽和的正丁醇萃取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣用甲醇10mL使溶解，作為供試品溶液。取10mL缺梔子的陰性溶液同法制得陰性對照溶液。另取梔子對照藥材0.5g，加乙醇20mL，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇5mL使溶解，作為梔子對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典一部附錄B）試驗，吸取供試品溶液和陰性溶液5μL以及對照藥材4μL分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水（15:1:1:2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。日光下檢視。3.3.1不同硅膠G薄層板的考察圖3-3-1手鋪板（T:20℃、RH:55%）圖3-3-2青島海洋化工（T:20℃、RH:55%）3.3.2不同濕度的考察圖3-3-3手鋪板（T:20℃、RH:88%）圖3-3-4手鋪板（T:20℃、RH:32%）3.3.3不同溫度的考察圖3-3-5手鋪板（T:4℃、RH:10%）圖3-3-6手鋪板（T:20℃、RH:55%）注：1~3供試品溶液（20171031、20171130、20171228）4對照藥材溶液5陰性對照溶液3.4甘草薄層鑒別取樣品溶液10mL，加水飽和的正丁醇萃取2次，每次20mL,合并正丁醇液，蒸干，殘渣用甲醇10mL使溶解，作為供試品溶液。取10mL缺甘草的陰性溶液同法制得陰性對照溶液。另取甘草對照藥材0.5g，加水適量濕潤，加水飽和的正丁醇20mL，超聲處理40min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5mL使溶解，作為甘草對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典一部附錄B）試驗，吸取供試品溶液和陰性溶液5μL以及對照藥材4μL分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水（15:1:1:2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。3.4.1不同硅膠G薄層板的考察圖3-4-1手鋪板（T:20℃RH:55%）圖3-4-2青島海洋化工（T:20℃RH:55%）3.4.2不同濕度的考察圖3-4-3手鋪板（T:20℃RH:32%）圖3-4-4手鋪板（T:20℃RH:88%）3.4.3不同溫度的考察圖3-4-5手鋪板（T:4℃RH:10%）圖3-4-6手鋪板（T:20℃RH:55%）注：1~3供試品溶液（20171031、20171130、20171228）4對照藥材溶液5陰性對照溶液3.5石韋薄層鑒別取尿石清合劑10mL，用乙酸乙酯-乙醇（8:1）的混合溶液提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用2mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取10mL缺石韋的陰性溶液同法制得陰性對照溶液。取石韋3g，水煮1h,濃縮至20mL，按供試品溶液制備的方法制得對照藥材溶液。分別吸取供試品溶液、陰性對照溶液各5μL、對照藥材溶液3μL于同一硅膠G薄層板上，以氯仿－丙酮－甲酸（10:2:0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液，熱風吹至斑點顯色，日光下檢視。3.5.1不同硅膠G薄層板的考察圖3-5-1手鋪板（T:21℃RH:55%)圖3-5-2青島海洋化工（T:21℃RH:55%）3.5.2不同溫度的考察圖3-5-3手鋪板（T:4℃RH:10%)圖3-5-4手鋪板（T:21℃RH:55%)3.5.3不同濕度的考察圖3-5-5手鋪板（T:21℃RH:32%)圖3-5-6手鋪板（T:21℃RH:88%)注：1~3供試品溶液（20171031、20171130、20171228）4對照藥材溶液5陰性對照溶液3.6廣金錢草薄層鑒別取樣品10mL,加稀鹽酸調節(jié)pH至2，用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加無水乙醇2mL使溶解，作為供試品溶液。取缺廣金錢草的陰性溶液10mL同法制得陰性對照溶液。取廣金錢草3g,水煎1h，濃縮至20mL，按供試品溶液制備的方法制得廣金錢草對照藥材溶液。分別吸取供試品溶液、陰性對照溶液6μL和對照藥材溶液3μL分別點于同一硅膠G薄層板，以甲苯－甲酸乙酯－甲酸（5:4:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，熱風吹干，置紫外光燈(365nm)下檢視。3.6.1不同硅膠G薄層板的考察圖3-6-1青島海洋化工（T:20℃RH:50%）圖3-6-2手鋪板（T:20℃RH:50%）3.6.2不同濕度的考察圖3-6-3手鋪板（T:20℃RH:32%）圖3-6-4青島海洋化（T:20℃RH:88%）3.6.3不同溫度的考察圖3-6-5青島海洋化工（T:4℃RH:10%）圖3-6-6青島海洋化工（T:20℃RH:50%）注：1~3供試品溶液（20171031、20171130、20171228）4對照藥材溶液5陰性對照溶。4梔子苷含量測定4.1色譜條件色譜柱：填充劑為十八烷基硅烷鍵和硅膠（Inertsil?ODS-35μm4.6×250mm）；流動相：甲醇-水（30:70）；檢測波長：236nm；流速為1mL/min；柱溫30℃；進樣量：20μL4.2進樣溶液的制備4.2.1供試品溶液精密量取2mL樣品于50mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度線，搖勻，精密量取10mL于20mL容量瓶中，定容，搖勻，吸取少量溶液微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。4.2.2陰性對照溶液精密量取2mL缺梔子的陰性溶液，按照樣品處理方法同法制得陰性對照溶液。4.2.3藥材對照溶液參考15版《中國藥典》一部中梔子的HPLC法。精密稱取0.1g的梔子粉末，加25mL甲醇，超聲處理20min，過濾，精密量取濾液10mL至50mL的容量瓶,加10mL水，用50%甲醇定容至刻度線，搖勻，取少量溶液微孔濾膜過濾，作為對照藥材溶液。4.2.4對照品溶液精密稱取5mg（實際為5.1mg）的梔子苷對照品于25mL容量瓶中，用50%色譜甲醇定容至刻度線，再精密量取1mL用50%色譜甲醇定容至10mL，即可。4.3方法學考察4.3.1專屬性在上述的色譜條件下，分別精密吸取2.2項下對照品溶液，對照藥材溶液供試品溶液和陰性對照溶液各20μL,分別注入液相色譜儀中，觀察四個色譜圖。結果，供試品色譜中有與對照品溶液、對照藥材色譜相同時間段的梔子苷峰，且陰性無干擾。如下圖4-3-1梔子苷對照品圖4-3-2梔子對照藥材圖4-3-3尿石清合劑（批號20171228）圖4-3-4陰性樣品對照4.3.2線性關系考察精密稱取5mg（實際上為5.1mg）梔子苷對照品于25mL容量瓶，用50%甲醇定容至刻度線，分別精密量取1mL用50%甲醇定容至20mL，再精密量取10mL用50%甲醇定容至20mL，作為1號組；精密量取1mL用50%甲醇定容至20mL，作為2號組；精密量取1mL用50%甲醇定容至10mL，作為3號組；精密量取2mL用50%甲醇定容至10mL,作為4號組；精密量取4mL用50%甲醇定容至10mL，作為5號組。吸取上述各組溶液各20μL，分別注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定，以峰面積對濃度進行回歸分析。結果梔子苷在0.00497～0.07956mg范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為：y=52658x+12.088,r=0.9997。標準曲線數(shù)據(jù)見表4-1，標準曲線見圖4-3-5表4-1對照品溶液梔子苷濃度與峰面積的線性關系編號12345濃度（mg/mL）0.004970.009950.019890.039780.07956峰面積265.5501.21093.72131.84185.4圖4-3-5梔子苷濃度-峰面積線性關系圖4.3.3精密度試驗取4.2.4項下的對照品溶液，按上述的色譜條件，連續(xù)測定5次。記錄峰面積，所得數(shù)據(jù)見表4-2。所得峰面積經(jīng)計算RSD值=1.52%。表4-2梔子苷精密度試驗峰面積記錄表編號12345峰面積1109.41111.11072.81091.01083.34.3.4穩(wěn)定性試驗取批號為20171228尿石清合劑，按2.2.1項下制成供試品，分別置0、1、3、6、24、48h后，分別測定其峰面積。記錄峰面積，見表4-3。所得面積經(jīng)計算RSD值=0.91%，表明樣品溶液在48h內基本穩(wěn)定。表4-3供試品溶液穩(wěn)定性試驗峰面積記錄表時間（h）01362448峰面積1370.91360.01363.11346.11339.01345.74.3.5重現(xiàn)性試驗精密量取同一批尿石清合劑（批號20171228）樣品5份．每份5mL，依2.2.1項下制成供試品溶液，分別進樣20μL，按上述色譜條件測定，記錄其峰面積，見表4-4。計算含量及其RSD值，結果梔子苷平均含量為1.269mg/mL，RSD=1.72%．表明該法重現(xiàn)性良好。表4-4重現(xiàn)性實驗峰面積記錄表編號12345峰面積1327.71369.81354.81370.91321.74.3.6加樣回收率試驗對照品溶液的制備：精密稱取6mg（實際為6.0mg）的梔子苷對照品，加入20mL容量瓶中，用50%甲醇溶解，搖勻。取已知含量為1.269mg/mL的尿石清合劑（批號20171228）樣品5份，每份約1mL，精密量取，分別精密加入上述制備的對照品溶液2mL,3mL,4mL,5mL,6mL。按“4.2.1”項下方法操作制成供試品溶液，再按“4.1”項下色譜條件測定其峰面積，計算加樣回收率，結果見表4-5，梔子苷的平均回收率為103.6%，RSD值=1.59%，表明該方法準確可靠。表4-5加樣回收率峰面積記錄表編號12345加入對照品的量（mg）0.58500.87751.17001.46251.7550供試品中梔子苷含量（mg）1.8832.1552.4862.7753.109回收率（%）105.0101.0104.0104.8103.64.4樣品含量測定取5批尿石清樣品按2.2.1項下制成供試品溶液，在2.1色譜條件測定其峰面積，記錄峰面積，代入回歸方程，計算含量。結果見表4-6。表4-6尿石清合劑梔子苷含量記錄表批號2017012020170912201710312017113020171228峰面積815.11293.21912.51751.31364.3梔子苷含量（mg/mL）0.7631.2161.8041.6511.284梔子所含梔子苷百分比（%）0.761.221.801.651.285討論5.1薄層鑒別研究因素變量討論因本次研究中藥數(shù)目較多，只做了濕度，溫度以及不同薄層板這三個因素的考察，且濕度，溫度，以及薄層板也都只設置了兩個變量。見表5-1表5-1方法學考察因素匯總表因素變量1變量2濕度88%（10.8mL硫酸+89mL水）32%（68mL硫酸+100mL水）溫度實驗那刻環(huán)境的溫度冰箱（4℃，10%）薄層板4%CMCNa的手鋪板青島海洋工廠以上這些因素隨機組合，進行考察。5.2車前子薄層鑒別研究結果討論車前子中主要成分為車前子多糖，故可以采用極性大的溶劑處理。對照藥材參考2015版《中國藥典》第一部采用甲醇超聲提取法制備。而樣品一開始也先是參照了2015版《中國藥典》第一部，以甲醇超聲提取法來處理樣品：先將樣品蒸干，甲醇溶解超聲，濾液蒸干，殘渣用甲醇溶解制成供試品。但色譜結果顯示供試品中無與對照藥材有相同斑點。后參考文獻方法[20-21]，樣品先用用乙醚和正丁醇分別提取兩次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣用甲醇溶解。結果，顯示，供試品中有與對照藥材相同的斑點，但斑點點被其他顏色的斑點覆蓋住，且陰性有干擾。即在原處理的基礎下，用80%的甲醇洗脫過柱（中性氧化鋁）去掉部分雜質。而我在這基礎上進行了改進，去掉了乙醚提取的過程。結果，供試品中有與對照藥材相同的熒黃色的斑點，且陰性無干擾，Rf值適中，特征性斑點清晰，分離度良好，具有專屬性。從不同因素考察的實驗結果來看，此法可以在不同的薄層板很好的鑒別車前子，但較低溫度，以及較大濕度的環(huán)境下，供試品的特征性斑點會淡點，但不會影響鑒別的結果；對照藥材則不受任何因素影響，證明此法具有一定的可行性。5.3川牛膝薄層鑒別研究結果討論川牛膝具有很強的特征性，正丁醇，氯仿，乙酸乙酯均可提取。而藥典中川牛膝的處理方法繁瑣，耗時長，所以不作為研究參考。采用參考文獻方法[22]，樣品直接用水飽和正丁醇提取，正丁醇液蒸干，殘渣甲醇溶解。能出現(xiàn)特征性斑點(木脂素類，顯亮紫色亮斑），但Rf較小，增加0.2的甲醇于展開劑，但出現(xiàn)展不平的情況，排除邊緣效應后還是會展不平。另有參考其它文獻方法[23]，做廣金錢草薄層鑒別研究時，發(fā)現(xiàn)川牛膝的特征性斑點（紫色亮斑），便按此方案進行川牛膝薄層鑒別。但，由于薄層板為聚酰胺薄膜，斑點很多，不是很美觀。便用硅膠G薄層板，以展開劑氯仿－丙酮－甲酸（10:2:0.5）進行展開，雖出現(xiàn)特征性藍紫色亮斑點，但Rf過大，當增加氯仿的比重，減少甲酸的比重，即氯仿－丙酮－甲酸（15:2:0.2）時，Rf較為理想，其值約為0.8，且特征性斑點明顯，展開水平基本一致，陰性無干擾，具有很強的專屬性。川牛膝的特征性斑點很強，所以對照藥材溶液的制備直接采用甲醇超聲提取制備，簡便，可行。方法學考察的色譜結果來看，濕度、溫度、薄層板這幾個因素并沒有對川牛膝的鑒別造成很大的影響，所以此法川牛膝的薄層鑒別具有一定的穩(wěn)定性、可行性。且樣品的處理采用毒性較小的乙酸乙酯，較人性化。5.4梔子、甘草薄層鑒別研究結果討論梔子和甘草也具有很強的特征性斑點。在梔子和甘草的薄層鑒別中，樣品與陰性樣品的處理方法是一樣的，可以減少鑒別的工作量，且處理的方法簡便。二者的特征性斑點都具有很強的顏色感，且都具有兩個特征性斑點。甘草的特征性斑點均為亮黃色，其中一個斑點被梔子的一個特征性斑點所覆蓋大半部分；而梔子的特征性斑點一個為藍綠色的斑點，但樣品受其它藥物斑點的影響，顯得很淡，只能隱隱約約的觀察到，另一個則很明顯，呈棕紅色，主要靠其來鑒別梔子。甘草的Rf值大于梔子的。由于薄層鑒別的化學成分在梔子和甘草中含量很高，所以實驗中的所需的對照藥材較少；且如果樣品與陰性樣品的量過多，制備成的點樣溶液濃度會過大；或者點樣量過大，均會出現(xiàn)拖尾的現(xiàn)象，展開結果為一條條色帶，不僅影響鑒別，而且不美觀。梔子和甘草的對照藥材均采用較為簡便超聲提取法處理，簡便可行。藥典中，梔子的處理也是超聲處理，但所用的溶劑為50%甲醇，甲醇有毒，而3.3中則用乙醇提取，較人性化。而藥典中甘草的處理極為繁瑣，所以不做研究參考。兩者在方法學考察中，幾乎不受溫度、濕度以及薄層板自身的影響，具有很強的穩(wěn)定性、可行性。5.5石韋薄層鑒別研究結果討論藥典中并無石韋的薄層鑒別記載，所以參考文獻[24]，采用乙酸乙酯震蕩提取，乙酸乙酯液蒸干，殘渣加乙醚10mL浸泡2min，棄乙醚，殘渣用乙醇溶解。對照藥材與陰性樣品同法處理。但實驗結果并不理想。參考文獻方法[25-26]，都是乙酸乙酯提取，只是少了乙醚環(huán)節(jié)，且展開劑和薄層板不一樣。所以，認為乙醚部分可有可無。參考文獻[24]制備成的供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液以文獻[25]中的色譜條件進行展開和觀察，結果依舊不理想。另參考文獻方法[26]，將前面回流部分直接去掉，直接用乙酸乙酯-乙醇（8:1）震蕩提取后，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，且色譜條件也與前面研究不一樣。所得結果理想，樣品中具有與對照藥材相同的棕色斑點，Rf值適中，且陰性無干擾，操作也簡便。方法學考察的結果顯示，溫度、濕度以及薄層板的制備方法對其結果影響不大，證明該法鑒別石韋具有一定的穩(wěn)定性、可行性。5.6廣金錢草薄層鑒別研究結果討論夏佛塔苷是廣金錢草中最具代表的化學成分，許多薄層鑒別都與夏佛塔苷有關。本次研究參考了文獻[20,23-24,27-28]，用80%甲醇超聲提取處理的樣品，雖然也有與對照藥材相同的點，且陰性無干擾，但特征性斑點過淡，且聚酰胺薄膜不是很好點樣，不如硅膠G板好用。也有乙酸乙酯震蕩提取，還有調pH值后再提取的。從中選取了最優(yōu)的，即調pH之后再用乙酸乙酯提取的方案。廣金錢草對照藥材的特征性斑點為藍紫色亮斑點，顏色和川牛膝的特征性斑點有點像，但廣金錢草的斑點顏色較淡些，且廣金錢草需噴顯色劑才能顯色，而川牛膝無需噴顯色劑。而樣品中的廣金錢草特征性斑點卻較藥材的淡許多，可能是在合劑生產(chǎn)的過程中不耐熱，而損耗很多。廣金錢草直接用乙酸乙酯提取處理也是可以，但薄層色譜出現(xiàn)的斑點過多，且廣金錢草的特征性斑點較淡，顯得有點雜亂，不美觀也不直觀。廣金錢草的特征性斑點的Rf值都偏大，約為0.8左右。方法學考察結果顯示，手鋪板展開的結果雖不影響廣金錢草的鑒別，但其他斑點分離度不好，而青島海洋工廠制作的薄層板展開的色譜結果較為美觀，其它斑點分離度良好。5.7梔子苷含量測定研究結果討論藥典中梔子苷含量測定的流動相為乙腈-水（15:85），但乙腈毒性大于甲醇，所以參考文獻[29]，選擇甲醇-水（20:80），但峰型有些飄，調節(jié)流動相為甲醇-水（30:70），此時峰分離度好，峰型也不飄，且出峰時間在6.4～7.2min之間,保留時間適宜。參考文獻[30]，檢測波長為236nm，結果對照品能出峰，樣品特征峰良好，且陰性無干擾，故梔子苷含量測定的檢測波長為263nm。一開始用甲醇配制對照品進樣，但有前緣肩峰，所以采用50%甲醇配制對照品進樣，梔子苷特征峰無前緣肩峰和拖尾，峰型對稱。樣品也采用50%甲醇直接稀釋過濾配制成供試品，結果也很理想，無肩峰也不拖尾，分離度良好。尿石清合劑的保質期為11個月，由于實驗中批號為20170120的尿石清合劑已經(jīng)過期，所以梔子苷含量較小，也不排除那一批所用的梔子的質量不過關?？傮w來看，尿石清合劑梔子苷的含量1.2～1.9mg/ml，實驗中也有兩批尿石清合劑所用的梔子達到2015版《中國藥典》第一部梔子中梔子苷含量。6結論薄層色譜法是鑒別中藥品種最簡捷可靠的方法。本次研究采用薄層色譜法對尿石清合劑中車前子、川牛膝、石韋、廣金錢草、梔子以及甘草進行鑒別研究，樣品、陰性樣品以及對照藥材的處理簡便，薄層色譜中特征性斑點清晰，無陰性干擾，分離度良好，建立了簡便、有效的薄層鑒別質量標準。梔子苷為梔子特有，且為梔子特征性化學成分，本實驗以梔子苷作為尿石清合劑含量測定的主要指標成分，特征性強，待測組分單一，本次研究擬定的梔子苷含量測定，方法可靠，樣品處理方法簡便，專屬性強，含量測定方法簡便、快捷、準確、重現(xiàn)性好，可作為尿石清合劑的質量標準，能有效的控制尿石清合劑的質量。為了使尿石清質量標準更加規(guī)范、合理，本次研究對中醫(yī)院制劑室提供的5個批次進行了實驗研究，但薄層鑒別研究只采用了對照藥材，未使用對照品，故薄層鑒別方法還有待完善，其次，本次研究的含量測定指標性成分較單一，可增加廣金錢草中夏佛塔苷的含量測定加以完善尿石清合劑的質量標準。參考文獻[1]黃新凱,賴海標,鐘喨,黃智鋒,曾曄,吳松.尿石清合劑對下焦?jié)駸嵝湍蚵方Y石患者上尿路動力學的影響[J].海南醫(yī)學,2017,28(14):2288-2291.[2]張曉方.車前子化學成分與藥理活性研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2014,10(12):33-34.[3]王隸書,李明洋,宋柏林,劉永宏.車前子多糖研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(02):460-462.[4]YinJY,NieSP,LiJ,etal.MechanismofInteractionsbetweenCalciumandViscousPolysaccharidefromtheSeedsofPlantagoasiaticaL.[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2012,60(32):7981-7987.[5]何永婷,朱賀年.車前子的研究進展[J].北方藥學,2011,8(01):55-57.[6]鐘鳴,柴玲.廣金錢草化學成分及藥理作用研究進展[J].廣西醫(yī)學,2018,40(01):80-82+91.[7]王昭.川牛膝現(xiàn)代研究進展[A].中國藥學會中藥與天然藥物專業(yè)委員會.第十屆全國中藥和天然藥物學術研討會論文集[C].中國藥學會中藥與天然藥物專業(yè)委員會:2009:3.[8]王立.川牛膝藥理作用的研究進展[A].中國商品學會.中國商品學會第五屆全國中藥商品學術大會論文集[C].中國商品學會:,2017:5.[9]YANGC,SHIJG,MOSY,etal.ChemicalconstituentsofPyrrosiapetiolosa[J].JAsianNatProdRes,2003,5(2):143-150.[10]鄭興,余麟,廖瑞芳,等.光石韋化學成分的研究[J].中草藥,1999,30(4):253-254.[11]上海第一醫(yī)學院,等.石韋治療慢性支氣管炎的有效成分研究[J].醫(yī)藥工業(yè),1973(6):1-13.[12]陳麗君,馬永杰,李玉鵬,張燕,何峰,陳業(yè)高.石韋屬植物化學和藥理研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(10):5786-5787+5798.[13]毛坤,夏新中,張虎,向麗娟.中藥石韋的藥理作用與臨床應用研究進展[J].長江大學學報(自科版),2014,11(06):110-113+6.[14]SimmlerC,NikolicD,LankinDC,etal.OrthogonalAnalysisUnderscorestheRelevanceofPrimaryandSecondaryMetabolitesinLicorice[J].JournalofNaturalProducts,2014,77(8):1806-1816.[15]張利.甘草的藥理作用及現(xiàn)代研究進展[J].中醫(yī)臨床研究,2014,6(10):147-148.[16]牧丹,蘇日那,格根塔娜,陳建平.梔子的化學成分與藥理作用研究[J].中國療養(yǎng)醫(yī)學,2015,24(01):34-36.[17]喬文,張顏文,吳壽金,天然環(huán)烯醚萜類化合物的生物活性[J].武警醫(yī)學院學報,2008,17(7):580-581.[18]郭曙軍,趙志英.梔子苷的藥理作用及其作用機制研究進展[J].包頭醫(yī)學院學報,2013,29(02):111-113.[19]YangQ,WuB,ShiY,etal.Bioactivity-guidedfractionationandanalysisofcompoundswithanti-influenzavirusactivityfromGardeniajasminoidesEllis.[J].ArchivesofPharmacalResearch,2012,35(1):9-17.[20]黎行山.復方廣金錢草顆粒質量標準研究[A].廣東省藥學會.2016年廣東省藥師周大會論文集[C].廣東省藥學會:,2015:10.[21]吳偉,梁山丹,廖厚知,莫少紅,陳曉軍.宮炎康顆粒的薄層色譜鑒別研究[J].海峽藥學,2010,22(11):82-84.[22]郝羚竹,商慧娟.豨紅通絡口服液質量標準的研究[J].中國藥品標準,2012,13(04):265-267.[23]李嘉,鄧治旭,黃建猷,龍杰超.尿炎清片的鑒別及鹽酸小檗堿的含量測定[J].華西藥學雜志,2007(01):95-97.[24]馬杰,孫焱,丁野,李文莉.復方石淋通膠囊質量標準的修訂研究[J].中國藥師,2015,18(08):1284-1286.[25]逯海龍,王新鳳.結石通片中茯苓、雞骨草、石韋的鑒別方法探討[J].寧夏醫(yī)學雜志,2002(06):376.[26]馮麗華,章紅,江豐.金錢通淋顆粒的薄層色譜鑒別[J].江西醫(yī)學院學報,2005(05):100-101.[27]趙志軍,葛智鑫.石淋通顆粒質量標準的研究[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2006(S2):783-785.[28]農(nóng)英高,莫海玲,于燦華.排石Ⅰ號顆粒劑質量標準研究[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化學成分的藥理作用研究較少；川牛膝則常與懷牛膝相對比較研究?？傮w而言，雖然每一味藥材都有對其化學成分藥理作用的機制做研究，但仍存在許多藥理作用機制不確定的，這塊仍存在很大的研究空間；再者，每一味藥的潛在利用都值得去研究，以便更好的應用于臨床中。由利尿通淋中藥組成的尿石清合劑雖然是較為簡單的劑型，但對其的質量標準研究也需更進一步。參考文獻[1]斯日棍其其格,董成海.車前子