原生質(zhì)體融合技術(shù)在生產(chǎn)廢水處理中的應(yīng)用

原生質(zhì)體融合技術(shù)在生產(chǎn)廢水處理中的應(yīng)用

20世紀(jì)60年代，原生質(zhì)體融合（proto癌）技術(shù)始于20世紀(jì)60年代。1960年法國的Karski研究小組在兩種不同類型的動物細(xì)胞混合培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了自發(fā)融合現(xiàn)象。同時,日本的Okada發(fā)現(xiàn)并證明了仙臺病毒可誘發(fā)內(nèi)艾氏腹水癌細(xì)胞彼此融合,從而開始了細(xì)胞融合的探討。1974年,匈牙利的Ferenczy采用離心力誘導(dǎo)的方法報道了白地霉(Geotrichumcandidum)營養(yǎng)缺陷型突變株的原生質(zhì)體融合,從而使原生質(zhì)體融合技術(shù)成為微生物育種的一項新技術(shù),并從微生物種內(nèi)融合擴展到界間的融合(如光合細(xì)菌與酵母菌的融合)。1979年匈牙利的Pesti首先提出了融合育種提高青霉素產(chǎn)量的報告,開創(chuàng)了原生質(zhì)體融合技術(shù)在實際工作中的應(yīng)用,使原生質(zhì)體融合技術(shù)成為工業(yè)菌株改良的重要手段之一。Hopwood等提出,原生質(zhì)體融合重組可能實現(xiàn)隱性基因的重組暴露,使一些隱性基因表達(dá)或隨機產(chǎn)生新的基因表型,從而使之成為鏈霉菌抗生素產(chǎn)生菌育種的新途徑。1原生質(zhì)體的制備、融合和再生技術(shù)微生物原生質(zhì)體融合技術(shù)的整個過程包括:原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生。國內(nèi)外學(xué)者在每一個關(guān)鍵技術(shù)上都做了大量的工作,取得了可喜的成就。1.1遺傳標(biāo)記的選擇與融合子的發(fā)現(xiàn)遺傳標(biāo)記的選擇實際上是融合子檢出的重要環(huán)節(jié),也是融合子檢出的標(biāo)記。1.1.1原生質(zhì)體的融合即融合的雙親為營養(yǎng)缺陷型,并且為不同的缺陷型。雙親缺陷的原生質(zhì)體融合后于基本培養(yǎng)基上選擇融合子,缺陷的單親原生質(zhì)體由于喪失了合成某種物質(zhì)的能力,在基本培養(yǎng)基上不能萌發(fā)生長,單親融合的原生質(zhì)體也不能長出菌落,雙親原生質(zhì)體融合后,缺陷的遺傳物質(zhì)得到互補可以恢復(fù)為野生型,在基本培養(yǎng)基上能夠萌發(fā)生長成為菌落。1.1.2基于細(xì)菌特性的融合子法微生物的抗藥性是其菌種的特性,是由遺傳物質(zhì)決定的。不同種的微生物對某一種藥物的抗性存在差異,利用這種差異或與菌種其它特性結(jié)合起來即可對融合子進行選擇。這種方法首先由Bradshaw和Peberdy于1984年使用。藥物的濃度過高會使融合頻率降低,濃度過低則會使親本生長,影響融合子的檢出。1.1.3利用紫外線照射滅活原生質(zhì)體融合子培養(yǎng)啤酒酵母新菌株原生質(zhì)體經(jīng)紫外線照射、加熱或經(jīng)某些化學(xué)藥劑的處理,可使其喪失在再生培養(yǎng)基上再生的能力,而只能作為遺傳物質(zhì)的供體。從而只根據(jù)另一親株特性設(shè)計選擇條件而選擇融合子。周東坡等通過紫外線照射滅活原生質(zhì)體融合選育了啤酒酵母新菌株。用0.1%碘乙酸,30℃處理產(chǎn)阮假絲酵母(Candidautilis)原生質(zhì)體40min后,與啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的原生質(zhì)體融合,利用形態(tài)差異選擇融合子。滅活原生質(zhì)體的機理認(rèn)為是:紫外線使菌株的DNA發(fā)生突變,熱的作用可使細(xì)胞內(nèi)有功能蛋白、酶蛋白變性失活,化學(xué)藥劑的作用能不可逆地抑制細(xì)胞代謝過程的關(guān)鍵酶,使之失活。1.1.4原生質(zhì)體的融合在酶解制備原生質(zhì)體時向酶解液中加入熒光色素,使雙親原生質(zhì)體分別帶上不同的熒光色素。帶上熒光色素的原生質(zhì)體仍能發(fā)生融合并具有再生能力。原生質(zhì)體融合處理后,在熒光顯微鏡下觀察并通過顯微操作,直接挑選出帶有兩種熒光的原生質(zhì)體。成亞利等以金針菇為材料,經(jīng)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的金針菇單核W19菌株的原生質(zhì)體與未經(jīng)標(biāo)記的單核Y7菌株的原生質(zhì)體在聚乙二醇的誘導(dǎo)下進行融合,得到融合菌株。1.1.5融合子的選擇利用親株對木糖的利用不同和對放線菌酮(Actidione,Ac)的抗性不同選擇融合子。如釀酒酵母(S.cerevisiae)89-1為呼吸完整,不能利用木糖,對Ac敏感。薛瓦酵母(S.chevalieri)Hy4呼吸完整,能利用木糖,抗100μg/mLAc。將89-1與HY4-RD雙親的原生質(zhì)體融合處理后,在含有木糖和20μg/mLAc的選擇培養(yǎng)基上選擇融合子。因為雙親原生質(zhì)體都不能生長,只有雙親遺傳物質(zhì)重組后才能在選擇培養(yǎng)基上萌發(fā)生長,從而被選擇出來。1.1.6抗藥性標(biāo)記聯(lián)合使用如圓褐固氮菌可以在無氮培養(yǎng)基上生長,可以與另外一種菌的抗藥性標(biāo)記聯(lián)合使用在無氮培養(yǎng)基上來篩選他們的融合子。光合細(xì)菌可以在無碳源的培養(yǎng)基上生長,可以與另外的標(biāo)記聯(lián)合使用在無碳培養(yǎng)基上來篩選其融合子。1.1.7使用其他標(biāo)記如熒光假單胞菌的熒光基因與芽孢桿菌的芽孢。1.2采用酶液強化原生質(zhì)體的形成速率和酶解溫度微生物細(xì)胞一般是有細(xì)胞壁的,進行該項技術(shù)的第一步就是制備原生質(zhì)體?，F(xiàn)在去除細(xì)胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要為蝸牛酶或溶菌酶,具體根據(jù)所用微生物的種類而定。影響原生質(zhì)體形成的因素很多,不同的微生物有其較為適當(dāng)?shù)男纬蓷l件。在菌齡選擇上,多采用對數(shù)生長期或生長中后期的菌,也有的采用生長后期的這主要是由于對數(shù)生長期細(xì)菌的壁中肽聚糖含量最低,細(xì)胞壁對酶的作用最敏感,但是對數(shù)生長早期的菌相對較為脆弱,受酶的過度作用會影響原生質(zhì)體的再生率。彭智華等對野生大杯蕈(Clitocybemaxima)進行原生質(zhì)體制備的過程中,用2種以上的酶液混合使用能提高去壁效果。陳海昌等證明,在一定范圍內(nèi),酶作用的時間、酶作用的濃度都與原生質(zhì)體的形成率成正相關(guān),而與再生率成反相關(guān)。林紅雨等采用酶解10分鐘后補加EDTA的方法,改變酶解環(huán)境中的離子強度和滲透壓,可以提高原生質(zhì)體形成率。CosteronJ.W.等(1967)報道,在高滲Tris溶液中添加1.5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等原生質(zhì)體擴張劑,有助于制備原生質(zhì)體,添加0.02mol/L鎂離子,有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定。1.3peg的應(yīng)用1974年,匈牙利的Ferenczy報道了離心力誘導(dǎo)法對白地霉(Geotrichumcandidum)營養(yǎng)缺陷型突變株的原生質(zhì)體融合。隨后人們相繼用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作為誘變劑進行融合,但融合頻率都很低。同年,Kao發(fā)現(xiàn)PEG在適量Ca2+存在下能有效地誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合,PEG種類對原生質(zhì)體融合的影響不大,從而使這一技術(shù)躍上了新的階段,大大提高了融合頻率。在融合方法上,除了傳統(tǒng)的化學(xué)方法外,1998年王金盛等報道了電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新技術(shù),進一步提高了融合頻率。1998年陳五嶺等又報道了激光誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合。此外,其融合率還受其它諸因素的影響。陳海昌等的研究證明原生質(zhì)體的融合受PEG和鈣離子的濃度及誘導(dǎo)融合時間的影響。林紅雨等采用在融合液中添加新生磷酸鈣的方法可以促進原生質(zhì)體融合。2原生質(zhì)體融合技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用2.1菌株融合子的篩選利用原生質(zhì)體融合技術(shù)不但可用于提高抗生素的產(chǎn)量,同時還可用于融合子產(chǎn)生新抗生素的研究,特別是在鏈霉菌育種中。賀敏霞等通過諾卡氏菌原生質(zhì)體融合重組發(fā)現(xiàn)4株融合子產(chǎn)生親本所沒有的簡體轉(zhuǎn)化中間體,3株融合子產(chǎn)生親本所沒有的抗生物質(zhì),還得到一株簡體轉(zhuǎn)化活力明顯高于親本的融合子。林榮團等以天然無抗菌活性的變青鏈霉菌1326與鏈霉菌1254營養(yǎng)缺陷型突變株進行種間原生質(zhì)體融合,篩選到5株抗菌活性較穩(wěn)定的菌株。曾洪梅等通過原生質(zhì)體融合的方法提高了農(nóng)抗武夷菌素的效價。陳五嶺等通過比較He-Ne激光和聚乙二醇(PEG)對紅霉素鏈霉菌(SE)和龜裂鏈霉菌(SR)滅活原生質(zhì)體的誘導(dǎo)融合,篩選得到幾株紅霉素產(chǎn)量與親本相比有明顯差異的融合子,產(chǎn)抗生素能力最多提高了28.04%。王金盛等以小諾霉素(Micronomicin,MCR)產(chǎn)生菌棘孢小單胞菌(Micromonsporaechinospora)為出發(fā)菌株,通過單親致死原生質(zhì)體融合,以鏈霉素為選擇條件選出融合株,篩得4株MCR百分含量高于親株的融合子。朱昌雄等通過用紫外線處理、低溫和紫外線復(fù)合處理、原生質(zhì)體加紫外線復(fù)合處理及原生質(zhì)體融合等4種育種方法,都能有效地提高中生菌素的效價。2.2原生質(zhì)體融合技術(shù)龐小燕等以酒精酵母和熱帶假絲酵母為親本,獲得了既具有糖化酶活性又能高產(chǎn)酒精穩(wěn)定的酵母融合株,具有良好的應(yīng)用前景。高年發(fā)等將釀酒酵母與粟酒裂殖酵母進行屬間原生質(zhì)體融合選育到降解蘋果酸強的菌株。高玉榮利用發(fā)酵力強的葡萄酒酵母與降酸能力強,發(fā)酵性能好的杰酒裂母融合,進行生物基因交換和重組,獲得的融合子降酸率可達(dá)30.4%,比葡萄酒酵母的降酸性提高20%。Kumari等將能夠分解纖維素的TrichodermareeseiQM9414和從葡萄糖產(chǎn)酒精的S.cerevisiaeNCIM3288進行融合,得到具有很強的將濾紙纖維素轉(zhuǎn)化為酒精的融合子。趙華等運用紫外線滅活原生質(zhì)體融合技術(shù),成功地對酒精酵母(K酵母)和產(chǎn)酯酵母(F2)進行了屬間細(xì)胞融合,獲得既具有高產(chǎn)酒特性,又具有高產(chǎn)酯特性的發(fā)酵性能穩(wěn)定的融合子FK3-27。王昌祿等利用紫外線致死原生質(zhì)體融合技術(shù),成功地將對紫外線敏感的嗜殺酵母菌株的嗜殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到CD4-W中,獲得的大量融合子經(jīng)嗜殺活性檢出實驗,小型釀造實驗,遺傳穩(wěn)定。杜連祥等利用PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)細(xì)胞融合技術(shù),將糖化酵母的糖化酶基因轉(zhuǎn)移到嗜殺啤酒酵母中,獲得1株高發(fā)酵度嗜殺啤酒酵母F-35-88菌株。S.cerevisiae在啤酒發(fā)酵后期能凝集并形成絮狀的酵母稱凝集性酵母,而沉淀不好的酵母稱為粉狀酵母。具有良好凝集性的酵母可使啤酒發(fā)酵液澄清速度加快,降低酵母分離時的能量消耗,并且還可防止酵母在發(fā)酵液中長時間懸浮導(dǎo)致細(xì)胞自溶而影響啤酒的風(fēng)味。啤酒酵母的凝集特性由其本身的遺傳特性決定。一般凝集性較好的啤酒酵母往往發(fā)酵度偏低。陳海昌等應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出的融合子FP19,既具有較高的發(fā)酵度又具有較強的凝集性。許多種微生物能在45℃～65℃生存,關(guān)于微生物耐熱性的機理研究得還不是很清楚,但其耐熱性卻有很重要的應(yīng)用價值。在酒精釀造中,釀酒酵母于40℃時產(chǎn)酒明顯下降。為此必須消耗大量能源降低發(fā)酵液的溫度。方靄祺等報道了以釀酒酵母396和假絲酵母C6為親本,通過原生質(zhì)體融合技術(shù),得到了一株在40℃培養(yǎng)條件下原料利用率為94.3%,乙醇產(chǎn)量為59.7g/L的屬間融合株。文鐵橋等通過PEG誘導(dǎo)碘乙酸滅活呼吸缺陷克魯維酵母原生質(zhì)體與釀酒酵母原生質(zhì)體融合,獲得45℃發(fā)酵產(chǎn)酒率高達(dá)8.7%的高溫酵母菌株AY006。2.3原生質(zhì)體融合技術(shù)通過原生質(zhì)體融合技術(shù)使兩個菌株的遺傳物質(zhì)得到重組,從而得到兼具兩個親本優(yōu)良性狀的新菌株。張清文等以多糖產(chǎn)生菌T和胡蘿卜素產(chǎn)生菌C1-B為雙親,用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出了1株既產(chǎn)多糖又產(chǎn)胡蘿卜素的雜交品系。韋革宏等利用原生質(zhì)體融合技術(shù),成功地獲得了RhizobiumleguminosoumUSDA2370和SinorhizobiumxinjiangnesisCCBAU110)的屬間融合菌株,可分別在雙親寄主植物上結(jié)瘤。融合菌株與親本菌株的生物學(xué)特性均不同。Jianxiu等將BacillusthuringiensisS184和TnX兩菌株進行融合,將cyt1Aa和cry11Aa基因成功地組合到一個菌株中,得到高毒力菌種。林紅雨等用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得能夠穩(wěn)定地將D-葡萄糖一步轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸的歐文氏菌和棒桿菌融合子。唐寶英等將具有解鉀活性的膠質(zhì)芽孢桿菌(B.mucilaginesus)W9-12與具有殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)B179208原生質(zhì)體進行了融合,融合子既具解鉀活性,又具具有殺蟲活性。陳五嶺等在雙親滅活原生質(zhì)體融合選育蘇云金桿菌新菌株的過程中,最終篩選出一株毒力效價較雙親分別提高41%和117%的新菌株。張修軍等以農(nóng)抗5102產(chǎn)生菌同源菌株90-11和FR-008進行原生質(zhì)體融合,篩選獲得1株兩親本均不具備的產(chǎn)抗細(xì)菌活性的融合子SR-7和1株各種抗菌活性均高于親本的融合子SR-T19。王憲川等應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù),得到了既殺鱗翅目昆蟲,又殺雙翅目害蟲的蘇云金桿菌重組菌株。又如枯草芽胞桿菌(B.subtilis)TG26產(chǎn)生抗菌蛋白,能抑制同種或不同種屬微生物的生長。B.thuringiensissubsp.PacifeusAS1.904產(chǎn)生伴胞晶體蛋白,能殺植物害蟲。王雅平等通過原生質(zhì)體融合獲得了能表達(dá)親株抗菌蛋白和毒素蛋白的融合株。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)對酶的研究是相當(dāng)廣泛的。研究最多的是淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶,主要用于提高菌種的產(chǎn)酶活力,改變菌種酶分泌的種類或使產(chǎn)酶菌種獲得新的優(yōu)良性狀等。日本W(wǎng)aseda大學(xué)應(yīng)用此技術(shù)以檸檬酸生產(chǎn)菌株黑曲霉(A.niger)和纖維素酶產(chǎn)生菌綠色木霉(Trichodermaviride)為親本,融合后篩選到能在甘蔗渣固體培養(yǎng)基上生長產(chǎn)生檸檬酸的融合子,兼具了綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的能力和黑曲霉產(chǎn)檸檬酸的能力。曹軍等以兩性霉素B抗性作為標(biāo)記,進行棲土曲霉種內(nèi)非營養(yǎng)缺陷型原生質(zhì)體融合,在40%的PEG-6000促融下,獲得穩(wěn)定的融合子,融合子為雜合二倍體,產(chǎn)角蛋白酶活力較親本顯著提高。2.4高效降解發(fā)酵技術(shù)利用微生物處理及利用污水是一個很有效的方法,但是這一技術(shù)的應(yīng)用往往涉及多種微生物,多種菌的優(yōu)化組合是一個很復(fù)雜的課題,原生質(zhì)體融合技術(shù)可以將多個功能組合到一個菌上,為其在污水處理上的應(yīng)用提供了良好的條件。許燕濱等采用原生質(zhì)體融合技術(shù),將兩株具有含氯有機化合物降解特性的菌假單胞菌T-1和諾卡氏菌RB-1融合構(gòu)建成一株高效降解含氯有機化合物工程菌,應(yīng)用于造紙漂白廢水,融合菌