生藥乙醇中微生物的抑菌活性研究

生藥乙醇中微生物的抑菌活性研究

造成的污染是嚴(yán)重的。尋找高效低毒的抗真菌藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。很多具有抗真菌活性的傳統(tǒng)中藥是值得開發(fā)的重要資源。麥角甾醇作為真菌細(xì)胞膜的構(gòu)建成分,沒有或缺少麥角甾醇,真菌就不能正常生長甚至死亡,通過尋找麥角甾醇生物合成的阻斷劑是尋找抗真菌藥物的重要手段之一。目前對抗真菌化學(xué)合成藥物的研究也主要集中在設(shè)計麥角甾醇的生物合成抑制劑,但從生藥中尋找麥角甾醇生物合成抑制劑作為抗真菌藥物的研究尚未見報道。威克海姆原藻(Protothecawickerhamii)寄生或腐生于木材、蔬菜和糞便中,引起人皮膚、皮下組織、口腔、鼻、漿膜等處病變,統(tǒng)稱無綠藻病(protothecosis),偶爾可引起系統(tǒng)性感染。臨床上把它歸為真菌病,用抗真菌藥物進(jìn)行治療。自Davies等1964年報道首例無綠藻病例,目前該病仍有上升趨勢,尚無特別有效的治療藥物,往往需要手術(shù)治療。啤酒酵母突變型GL7(SaccharomycescerevisiaeGL7)自身不能合成甾醇,需飼喂甾醇以維持正常生長,因此可對其生物合成途徑進(jìn)行監(jiān)測。這兩種微生物的生物合成途徑已被闡明,二者的甾醇生物合成途徑不同,因此應(yīng)用這兩種微生物有利于研究抗真菌天然產(chǎn)物對甾醇生物合成途徑的影響。為此作者選擇了已有報道的有較好抗真菌活性的中藥川芎、梔子、黃柏、丁香、紫草、烏梅、使君子、白芷、黃連、龍膽、秦艽、防己、山豆根等藥材的醇提物及天然產(chǎn)物進(jìn)行了啤酒酵母突變型GL7和威克海姆原藻的敏感性測試,以期從天然產(chǎn)物中尋找作用靶點在甾醇生物合成途徑上的抗真菌藥物,為開發(fā)高效低毒的抗真菌天然藥物奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1原藻菌種w.kraft啤酒酵母突變型GL7(SaccharomycescerevisiaeGL7)和威克海姆原藻(Protothecawickerhamii)菌種均由W.DavidNes博士(DepartmentofChemistryandBiochemistry,TexasTechUniversity,Lubbock79409,TX,USA)贈送。1.2儀器HZQ-Q全溫振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司),酶標(biāo)儀(BioRad550型)。1.3試劑和儀器蛋白胨(Peptone,購自DIFCO公司),酵母提取物(YeastExtract,購自O(shè)XOID公司),葡萄糖(汕頭市光華化學(xué)廠),兩性霉素B(AmB,購自GIBCO公司),噻唑藍(lán)(MTT,購自北京原平生物技術(shù)公司),酮康唑(西安楊森制藥有限公司),試劑均為分析純。1.4方法1.4.1微生物細(xì)胞的制備培養(yǎng)基為蛋白胨2%,葡萄糖2%,酵母提取物1%,每瓶接種適量微生物細(xì)胞,終濃度為104cfu/mL。置于30℃,100r/min搖床培養(yǎng)。1.4.2乙醇浸膏的制備生藥粗提物的制備,生藥各250g,粉碎,過20目篩,分次用70%乙醇浸72h,每次加5倍量乙醇,共3次,濾過,濾液合并,減壓回收乙醇得流浸膏。流浸膏用70%乙醇配成1∶1藥液,用培養(yǎng)基分別稀釋成1/10,1/20,1/40,1/80濃度,于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.4.3抗菌活性的測定(1)顯微鏡直接計數(shù)法,用血球計數(shù)板在鏡下(400X)計數(shù)。為了區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞采用活體染色法。用美藍(lán)配成一定的濃度,再與等體積的細(xì)胞懸液混合,經(jīng)一段時間后,活細(xì)胞表現(xiàn)出無色,而衰老或死亡的細(xì)胞呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。(2)MTT法,MTT用磷酸緩沖液(0.2mol/LPSB,pH7.2)溶解配成1mg/mL溶液,藥物配成3mg/mL母液,MTT及藥液均用0.45μm微孔濾膜過濾滅菌。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在紫外燈下照射40min。第一孔藥物終濃度為1mg/mL,依次稀釋10倍或?qū)Ρ断♂?以不加藥液為陰性對照,兩性霉素B為陽性對照。每孔加0.1mL菌懸液(細(xì)胞終濃度為104cfu/mL)。作3組重復(fù)。置30℃培養(yǎng)3h,每孔加50μLMTT,15min后產(chǎn)生藍(lán)色顆粒,3000r/min離心10min,吸棄上清液,每孔加100μL二甲基亞砜(DMSO),振蕩10min以徹底溶解顆粒,用酶標(biāo)儀570/630nm讀取吸光度值。(3)MIC80與MIC100的確定,MIC80為與對照相比抑制80%生長的最低藥物濃度。MIC80作為抗真菌劑(fungistatic)的最低抑菌濃度,即雖未殺死細(xì)胞但抑制其生長。MIC100為沒有可見的細(xì)胞生長的最低藥物濃度。MIC100為殺真菌劑(fungicide)的最低抑菌濃度。精確稱取一定量的藥品,用DMSO溶解,配成一定濃度的藥液,再稀釋成不同濃度。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種含藥的培養(yǎng)基中,細(xì)胞終濃度為104cfu/mL,于30℃恒溫箱中培養(yǎng),48h在不攪動情況下用肉眼觀察,溶液澄清透明視為無細(xì)胞生長,取完全不生長管最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。2抗真菌生物活性成分生藥醇提物及生藥活性成分對P.wickerhamii及S.cerevisiaeGL7的抑制效果如表1,2所示。從表中可知黃柏、丁香、烏梅、黃連、山豆根對二者均有強烈抑制作用,紫草、龍膽對S.cerevisiaeGL7抑制作用很強,而對P.wickerhamii則無作用。反之,白芷對P.wickerhamii有較好的抑制作用,卻對S.cerevisiaeGL7的生長無影響。可見各種藥物對細(xì)胞作用機制不同,導(dǎo)致其對不同種類細(xì)胞抑制效果的差異。如果能闡明一種藥物對微生物的作用機制,則用其作為治療藥物可減少盲目性,提高治療效率。幾種生藥活性成分對兩種微生物的抑制效果如表2所示,小檗堿對P.wickerhamii的抑制效果好于對S.cerevisiaeGL7的抑制效果,紫草素則相反,對S.cerevisiaeGL7有較好的抑制效果。其他幾種天然產(chǎn)物則未表現(xiàn)出好的抗真菌活性。經(jīng)作者實驗證明這幾種天然產(chǎn)物的作用靶點也不在甾醇生物合成途徑上。幾種抗真菌生物活性成分對P.wickerhamii和S.cerevisiaeGL7的最低抑菌濃度如表3所示。酮康唑(ketoconazole)是臨床上廣泛應(yīng)用的治療系統(tǒng)性真菌病的藥物,作用靶點是甾醇生物合成途徑中的14位去甲基酶。24-(R,S)-25-epiminolanosterol是一種化學(xué)合成的24-甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶的真菌甾醇生物合成抑制劑。為此本實驗以酮康唑和24-(R,S)-25-epiminolanosterol為陽性對照樣品。從表中可見各種抗真菌劑對兩種微生物的敏感性有差異,其中澳洲茄胺與24-(R,S)-25-epiminolanosterol對P.wickerhamii和S.cerevisiaeGL7的最低抑菌濃度差異更大,P.wickerhamii和S.cerevisiaeGL7的甾醇生物合成途徑有較大差異,經(jīng)作者研究表明澳洲茄胺抗真菌作用的主要靶點在甾醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶24-甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶(sterolC-24methyltransferase)上。澳洲茄胺對P.wickerhamii的MIC是S.cerevisiaeGL7的MIC1/40,在P.wickerhamii中甾醇生物合成途徑中24位甲基化反應(yīng)是第一步反應(yīng),在14位去甲基反應(yīng)和8(9)位雙鍵移位之前,此步被抑制后累積前體環(huán)陳屯醇(cycloartenol),其不但不能支持微生物的生長,反而對細(xì)胞膜有損害作用。而在S.cerevisiaeGL7中甲基化酶抑制劑的加入將引起酵母甾醇的累積,酵母甾醇的結(jié)構(gòu)與麥角甾醇更多相似之處,可部分地起