不同環(huán)節(jié)干片對免疫組化染色的影響

不同環(huán)節(jié)干片對免疫組化染色的影響

免疫組染色是病理診斷中非常重要的一種非常重要的輔助診斷方法，也是許多科學(xué)研究項目中應(yīng)使用的基本實驗方法。此染色方法步驟較多,對染色結(jié)果的影響因素也較多,因此我們必須嚴(yán)格按照操作規(guī)范來進(jìn)行操作,以提供可靠的實驗結(jié)果。在實際操作中,老一輩的免疫組化工作者總是提醒我們不要“干片”。所謂“干片”,就是指在整個免疫組化染色過程中組織上覆蓋的液體(抗體、顯色液、蒸餾水、PBS(磷酸鹽緩沖液)等)由于揮發(fā)或在液體表面張力的作用下收縮,導(dǎo)致組織直接裸露在空氣中的情況,還有就是熱修復(fù)時修復(fù)液過少造成組織浸泡不到。干片會造成何種影響呢?下面我們以目前比較常用的非生物素試劑盒“Elivision-plus法”中的操作步驟進(jìn)行說明。先列出此方法具體步驟:(1)石蠟切片脫蠟和水化后,用PBS(pH7.4)沖洗3次,每次3分鐘;(2)根據(jù)一抗的要求,對組織抗原進(jìn)行微波修復(fù)、胃酶修復(fù)或EDTA修復(fù),蒸餾水洗一次,再用PBS沖洗3次,每次3分鐘;(3)每滴切片加50μ3%過氧化氫溶液,室溫下孵育10分鐘,PBS沖洗3次,每次3分鐘;(4)甩去PBS,每張切片加約50μl第一抗體,室溫下孵育60分鐘,PBS沖洗3次,每次5分鐘;(5)甩去PBS,每張切片加約50μl聚合物增強劑,室溫下孵育20分鐘,PBS沖洗3次,每次3分鐘;(6)甩去PBS,每張切片加約50μl酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物,室溫下孵育30分鐘,PBS沖洗3次,每次3分鐘;(7)甩去PBS,每張切片加約100μl新鮮配置的DAB顯色液,顯微鏡下觀察3~10分鐘,陽性顯色為棕色;(8)蒸餾水沖洗,再自來水沖洗,蘇木素復(fù)染2分鐘,1%鹽酸酒精分化3秒,自來水沖洗15分鐘返藍(lán);(9)由低到高梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。由以上步驟可以看出,免疫組化全程幾乎都與液體打交道。理想狀態(tài)下,組織片始終是處于一種濕潤狀態(tài)的,而為了保證組織濕潤,我們會把組織片放在“濕盒”中進(jìn)行孵育。在實際操作中,會有很多環(huán)節(jié)可能導(dǎo)致干片,具體分為幾種情況:一是修復(fù)時修復(fù)液過少造成組織浸泡不全;二是沖洗時放置時間過長或沖洗液過少造成干片;三是滴加試劑時忘記滴加或試劑不夠或滴加后忘記蓋上濕盒的蓋子造成干片。全程滴加的試劑分別是雙氧水(10min)、一抗(60min或室溫過中午或4℃過夜)、增強劑(20min)、聚合物(30min)、DAB顯色液(3~10min)、蘇木素(2min)。其中一抗是最重要也是孵育時間最長的一個環(huán)節(jié),如發(fā)生干片影響也最大。其余試劑大都孵育時間較短,只要滴加試劑量足夠,即便未放入濕盒也相對不易干片。因此我們在這一環(huán)節(jié)就選用一抗作為代表來研究干片造成的影響。1材料和方法1.1微波型抗體(1)隨機抽取本科室30例乳腺癌標(biāo)本,每例各切4張切片,分為4組。(2)福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供的ER濃縮型抗體,產(chǎn)品編號:RMA-0501,克隆號:SP1,預(yù)處理:高溫修復(fù)(檸檬酸),陽性部位:胞核。(3)家用750W格蘭仕微波爐一臺;(4)福州邁新公司提供的Elivision-plus試劑盒;(5)檸檬酸鹽抗原修復(fù)緩沖液(粉劑)(0.01M,pH6.0);(6)福州邁新公司提供的DAB試劑盒,DAB-0031;(7)酒精、二甲苯;蘇木素。1.2方法1.2.1第二組在修復(fù)時加入不足夠的修復(fù)液,及時對切片的干片第一組為對照組,按Elivision-plus正常步驟操作;第二組在修復(fù)時加入不足夠的修復(fù)液,人為造成干片;第三組在修復(fù)后直接將切片在空氣中晾干,人為造成干片;第四組在滴加一抗后并不蓋上濕盒的蓋子,造成干片。其余操作完全同第一組。1.2.2采用統(tǒng)計軟件spss130，卡方驗證2干片對免疫組化的影響顯微鏡鏡下閱片,ER在乳腺癌細(xì)胞胞核呈現(xiàn)較均勻棕褐色著色。在胞核以外的部位出現(xiàn)類似深淺不一的棕褐色著色即為背景。陽性染色強度按照以下標(biāo)準(zhǔn):無陽性染色為-;弱陽性染色為+,較強陽性染色為++;最強陽性染色為+++。背景染色強度按照以下標(biāo)準(zhǔn):無背景染色為-;背景染色與弱陽性染色相當(dāng)為+;背景染色與較強陽性染色相當(dāng)為++。當(dāng)修復(fù)液不足時,主要影響陽性表達(dá)。淹沒部分基本不影響,而未淹沒部分則造成干片,全部為陰性,分界明顯;但背景依然清晰,未受影響。修復(fù)后晾干與正常步驟操作的結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),對染色結(jié)果無影響。滴加一抗后如果干片,對染色結(jié)果影響很大(與正常操作步驟比較P<0.01)。本次試驗雖然基本上也都有表達(dá),但總體偏弱,而且表達(dá)不均勻。少數(shù)地方強,但大部分地方弱,某些局部甚至陰性。對背景影響尤為明顯,整張片子顯得比較黃而且不太透明,邊緣效應(yīng)也較常見。干片對免疫組化不同環(huán)節(jié)影響的情況見表1。染色結(jié)果如圖1~4所示。3免疫組化干片的修復(fù)和滴加抗體本次實驗之所以選擇ER,是因為它是臨床診斷最常應(yīng)用的抗體之一,是很成熟、表達(dá)很穩(wěn)定的抗體。它的表達(dá)部位在胞核,十分有利于觀察,也有利于區(qū)別背景著色。“不要干片”是免疫組化操作中的一個原則,但大多書籍、文獻(xiàn)報道比較籠統(tǒng),缺乏細(xì)致的比較以區(qū)別對待。之所以要研究不同環(huán)節(jié)干片所造成的影響,就是想探索干片造成影響的原理,以方便我們更加正確和便捷地處理免疫組化操作。實驗已證明,在修復(fù)環(huán)節(jié),是絕對不能干片的,因為這會導(dǎo)致假陰性。修復(fù)液的pH值對修復(fù)效果影響顯著,未浸泡到部分雖然能達(dá)到相應(yīng)溫度,但無法滿足其要求的pH值環(huán)境?！靶迯?fù)后晾干”代表各個沖洗環(huán)節(jié),包括自來水洗、蒸餾水洗、PBS洗等。這些環(huán)節(jié)原本也不容易發(fā)生干片,只是在修復(fù)后滴加抗體前要先給玻片“畫圈”(即將組織周圍的水分擦干,然后用PAP筆(免疫組化筆)在組織周圍1~2mm的玻片上畫一個完整的圈,以防止滴加試劑后試劑向周圍流失),在這個過程中組織往往會部分干片。許多人擔(dān)心這會造成背景,其實大可不必?fù)?dān)心,事實證明此階段的干片對染色結(jié)果基本無影響。那么,我們以后在畫圈時也不必再要求“迅速、麻利”了。滴加抗體后,在張力作用下,抗體有向中間收縮的趨勢,加上試劑的邊緣揮發(fā)較快,水分揮發(fā)后,組織邊緣的抗體濃度實際上是增高了,因此染色會偏深,也容易出現(xiàn)非特異著色;如果邊緣揮發(fā)明顯,則會造成干片,可出現(xiàn)假陽性及很深的背景。在濕盒中由于濕度很大,基本能抑制液體揮發(fā)。一抗作用時間長,如果干片,局部試劑能