腎盂內(nèi)高壓灌注動物模型的建立及其對腎單位結(jié)構(gòu)的影響

腎盂內(nèi)高壓灌注動物模型的建立及其對腎單位結(jié)構(gòu)的影響

近年來，腔鏡技術(shù)在尿科領(lǐng)域迅速發(fā)展，并已成為治療各種疾病的流行技術(shù)。尤其是仙女骨關(guān)節(jié)的形成逐漸取代了開放手術(shù)。膀胱內(nèi)的腔鏡手術(shù)需要注入清潔的液體，以保持手術(shù)領(lǐng)域的清晰性。然而，由于粘膜出血、管腔狹窄和大石頭塌陷等原因，手術(shù)困難，手術(shù)時間延長，腎盂高壓注射。腎盂內(nèi)高壓不但會造成腎單位的損害,更有甚者會造成腎破裂而死亡。我們建立腎盂內(nèi)高壓灌流的動物模型,觀察腎盂內(nèi)高壓灌流對腎單位結(jié)構(gòu)的影響,探討輸尿管鏡及經(jīng)皮腎鏡時腎盂內(nèi)灌流的安全壓力。1對象和方法1.1腎私家車管輸液管分離健康實驗用豬4只(腎臟8個),體重31.55~45kg,平均37.71kg。氯胺酮10~20mg/kg,安定5~10mg/kg肌注后,阿托品0.5~1.0mg肌注解痙,氣管插管后,5%戊巴比鈉靜脈維持。經(jīng)腹部正中切口,于結(jié)腸旁溝處打開側(cè)腹膜,分離腎臟和輸尿管,于腎盂輸尿管交界遠端2cm處剪開輸尿管,插入輸液管至腎盂并固定,遠端輸尿管封閉,將充滿液的輸液管水平接至壓力感受器測腎盂基礎(chǔ)內(nèi)壓;再通過三通連接灌注泵,灌注生理鹽水,至腎盂灌注壓分別增高到6.67kPa、13.33kPa、20.00kPa、26.66kPa(50mmHg、100mmHg、150mmHg、200mmHg)保持10min后用18G穿刺針取腎上、中、下三處15mm腎組織固定后送檢,作為第一階段腎組織標本。第二階段在第一階段基礎(chǔ)上分四組即(6.67kPa組、13.33kPa組、20.00kPa組、26.66kPa組)在恢復(fù)常壓10min后再分別增壓到6.67kPa、13.33kPa、20.00kPa、26.66kPa保持10min后取標本,恢復(fù)常壓10min后再重復(fù)一次。對側(cè)無灌注腎臟亦作穿刺,作為對照組標本。1.2雙氧鈾塊染法前固定:2%戊二醛PBS固定液固定2h,4℃。漂洗:PBS緩沖液洗滌2次,每次10min,4℃。后固定:1%鋨酸PBS固定液固定2h,4℃。漂洗:PBS緩沖液洗滌2次,每次10min,4℃。脫水:30%~50%~70%乙醇逐級脫水每次10min。(70%乙醇含3%醋酸雙氧鈾)4℃塊染。80%~95%~100%~100%乙醇逐級脫水,每次10min。置換:環(huán)氧丙烷,二次,每次10min。浸透:環(huán)氧樹脂618包埋液與環(huán)氧丙烷1∶12h。環(huán)氧樹脂618包埋液與環(huán)氧丙烷2∶1過夜。純環(huán)氧樹脂618包埋液浸透,37℃,6h。包埋:60℃烘箱內(nèi)48h。切片:LKBV型超薄切片機切片。染色:枸櫞酸鉛電子染色。觀察:PHILIP(荷蘭菲利浦公司)CM-120透射電鏡觀察腎小球、腎小囊、近曲腎小管及腎間質(zhì)的改變。2結(jié)果2.1腎盂內(nèi)基礎(chǔ)壓實驗豬腎盂內(nèi)基礎(chǔ)壓0.8~1.1kPa,平均(0.95±0.15)kPa,與人類腎盂內(nèi)壓0.98kPa相近。2.2腎組織病理學(xué)觀察腎盂內(nèi)灌流壓為6.67kPa時,第一個10min,腎小球毛細血管上皮細胞(足細胞)足突排列整齊,足突間連接緊密,腎小囊基底膜連續(xù)性完好,近曲腎小管腔面微絨毛排列規(guī)則。20min、30min,在電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)變化不大。腎盂內(nèi)灌流壓為13.33kPa時,第一個10min,腎小球足細胞足突排列整齊,連接緊密,腎小囊基底膜完好,近曲腎小管細胞腔面微絨毛排列規(guī)則(圖1)。20min時,腎小球、腎小囊結(jié)構(gòu)無變化,但可見部分腎小管上皮細胞內(nèi)空泡形成,微絨毛排列雜亂、稀疏,部分微絨毛脫落(圖2)。30min時,腎小球、腎小囊無變化,腎小管上皮細胞內(nèi)空泡形成明顯,有大片微絨毛脫落,偶見細胞溶解(圖3)。腎盂內(nèi)灌流壓為20.00kPa時,第一個10min,腎小球、腎小囊結(jié)構(gòu)無變化,近曲腎小管細胞亦變化不大。20min時,腎小球、腎小囊結(jié)構(gòu)變化不明顯,腎小管上皮細胞內(nèi)空泡大量形成,微絨毛脫落,細胞內(nèi)吞噬溶酶體增多,可見部分細胞的細胞膜、核膜及細胞器膜性結(jié)構(gòu)破裂(圖4)。30min時,腎小球、腎小囊管腔飽滿,足突間的間隙變寬,腎間質(zhì)組織腫脹,腎小管上皮細胞腔面微絨毛大片團狀脫落,可見部分細胞溶解(圖5)。腎盂內(nèi)灌流壓為26.66kPa時,第一個10min,足細胞足突排列尚整齊,腎小囊基底膜連續(xù),但可觀察到腎小管上皮細胞內(nèi)空泡形成,微絨毛排列雜亂,部分微絨毛脫落,細胞內(nèi)吞噬溶酶體增多(圖6)。20min,可見部分腎小球、腎小囊飽滿,多處腎小管微絨毛脫落,胞質(zhì)內(nèi)線粒體、溶酶體擴張,部分細胞分解、破裂,腎間質(zhì)有水腫(圖7)。30min,可見足突腫脹,足突間的間隙變寬,腎間質(zhì)腫脹明顯,有巨噬細胞侵潤,腎小管上皮細胞團狀脫落,部分細胞溶解壞死(圖8,9)。3腎單位損害的發(fā)生此實驗研究是吳榮佩動物研究的延續(xù)和發(fā)展,2006年,吳榮佩等在健康豬腎做了單純性腎盂內(nèi)高壓灌注對腎單位影響的實驗研究,分別在6.67、13.33、20.00、26.66、33.33、40.00kPa各級壓力下灌流10min,實驗中輸尿管腎盂是在封閉狀態(tài)恒壓下腎盂內(nèi)壓等于灌流壓,在每個壓力狀態(tài)下于腎上極、腎凸緣、腎下極各穿刺獲取腎實質(zhì)組織,在透視電鏡下觀察腎小球、腎小囊及近曲腎小管的形態(tài)變化,得出了腎盂內(nèi)壓不超過26.66kPa,可避免對腎單位造成結(jié)構(gòu)破壞的結(jié)論。而在臨床實踐中我們發(fā)現(xiàn)接受灌流操作的患者腎臟可能已有腎積水等病變,且在操作中一度致腎內(nèi)壓升高的時間可大大超過10min,即使灌注壓力不超過26.66kPa,也可能造成腎單位損傷,因此我們設(shè)計了此實驗研究。實驗研究發(fā)現(xiàn)腎盂內(nèi)灌注壓在6.67kPa時,在不同的時間累積里,腎小球、腎小囊、近曲腎小管及腎間質(zhì)的改變不明顯。腎盂內(nèi)灌注壓在13.33~26.66kPa時,在不同的時間累積里,腎小球、腎小囊的改變不明顯;但近曲腎小管及腎間質(zhì)的損傷改變明顯,近曲腎小管上皮細胞微絨毛脫落、細胞膜及細胞器破裂等,腎間質(zhì)腫脹、炎性細胞侵潤等變化,并隨時間積累而加劇。實驗中我們發(fā)現(xiàn)腎單位中各組織的損害除壓力大小時間外(壓力與時間有關(guān)外),還與各組織在壓力傳遞的梯級和本身對壓力的耐受有關(guān)。腎盂和集合管是壓力傳遞的第一梯級,由于本身有舒張性,所以各種壓力對它影響不大;腎小球、腎小囊是壓力傳遞的最末梯級,除非是極高壓(26.66kPa以上)很難對它產(chǎn)生影響;遠曲腎小管、近曲腎小管是壓力傳遞的中間梯級,近曲小管由于上皮細胞存在微絨毛結(jié)構(gòu)最易受損。近曲腎小管能重吸收腎小囊濾液中幾乎全部葡萄糖、氨基酸和蛋白質(zhì),以及65%的Na、85%的水和50%的尿素等;近曲小管上皮細胞還向管腔分泌H+、氨、肌酐和馬尿酸,轉(zhuǎn)運排出血液中酚紅和青霉素等藥物;因此,近曲小管的損害可嚴重影響腎的正常排泄功能。我們還發(fā)現(xiàn),隨著時間的推移,各壓力下,腎間質(zhì)的變化明顯;而在臨床上也發(fā)現(xiàn)有些病患反復(fù)做多次輸尿管鏡碎石失敗開放手術(shù)中發(fā)現(xiàn)腎纖維化的表現(xiàn)。是否與腎間質(zhì)變化有關(guān),需做遠期變化的動物實驗。自從用輸尿管鏡開展輸尿管檢查治療及經(jīng)皮腎盂檢查治療以來,為輸尿管結(jié)石和腎結(jié)石開創(chuàng)了嶄新的途徑,為廣大病患帶來了福音;在操作中,為了保持視野清晰,我們常用灌注泵(壓力0~53.33kPa)進行灌流,一般在流出道通暢的情況下,腎盂輸尿管都保持低壓狀態(tài),但在碎石或血塊堵塞流出道時可致腎盂內(nèi)壓增高,達13.33kPa以上,有的甚至超過26.66kPa,對腎單位造成損害;這