164種中藥抗真菌藥敏試驗(yàn)研究

164種中藥抗真菌藥敏試驗(yàn)研究

真菌病的發(fā)病率正在增加?？拐婢幬铮ǘ悦顾豣、羥色胺、托吡魯酯等）對(duì)真菌病有效，但對(duì)高效低毒、抗真菌譜和耐藥性方面沒(méi)有滿(mǎn)意的藥物。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)中草藥抗真菌試驗(yàn)作了大量篩選,其中大蒜,黃連,黃柏,白蘚皮,土槿皮的抗真菌能力較強(qiáng)。但各作者對(duì)中藥材的提取方法有較大差異,主要為水煎劑,生理鹽水、醋、酒等浸出劑。提取的有效成分不完全,并且為了抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),藥物與培養(yǎng)基共同滅菌,而加熱后可使某些藥物失效。本研究是從祖國(guó)醫(yī)書(shū)記載,老中醫(yī)治療真菌病的驗(yàn)方及文獻(xiàn)報(bào)道具有抑制真菌的藥物中,選出164種中藥材,應(yīng)用95%乙醇超聲提取藥物成分,經(jīng)真空干燥后,以二甲基亞砜配制溶液,體外觀察藥物對(duì)3種真菌的作用。為進(jìn)一步分析單味藥中最有效的藥物成分,探討作用機(jī)制,動(dòng)物試驗(yàn)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。白色念珠菌Candidaalbicans(Robin)Berkh.是念珠菌屬中致病力最強(qiáng)的一種,也是念珠菌病最常見(jiàn)的病原體。威克海姆原藻(Protothecawicherhamii)屬于無(wú)綠藻,可引起人皮膚、皮下組織、口腔、鼻、漿膜等處的病變。啤酒酵母GL-7(SaccharomycescereisiaeHansenGL-7)是啤酒酵母的甾醇營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株,對(duì)于研究甾醇的生物合成途徑是很好的模式菌。1單體化合物中國(guó)藥品化學(xué)品檢定所163種中藥材(購(gòu)自北京同仁堂藥店),土槿皮(1999年秋采于浙江省衢州市,由果德安教授鑒定),單體化合物(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)。兩性霉素B(購(gòu)自Sigma公司),蛋白胨(購(gòu)自DIFCO公司),酵母提取物(購(gòu)自O(shè)XIOID公司),葡萄糖(汕頭市光華化學(xué)廠),瓊脂(北京原平生物技術(shù)有限公司),麥角甾醇(購(gòu)自Sigma公司),所用實(shí)驗(yàn)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。2方法和結(jié)果2.1中藥乙醇浸膏的制備中藥材50g研成粉末,過(guò)20目篩,5倍量的95%乙醇浸泡24h,超聲提取30min,抽濾后再經(jīng)3倍量的90%乙醇超聲提取20min,兩次提取液合并,減壓回收乙醇,60℃真空恒溫干燥,得中藥材乙醇浸膏。將中藥醇提物用二甲基亞砜溶解,并稀釋為3個(gè)濃度,藥物終濃度分別為10,1,0.1mg/mL。二甲基亞砜終濃度為2.5%。單體化合物和兩性霉素B用最低量的二甲基亞砜溶解,無(wú)菌水稀釋,單體化合物的最終作用濃度為1000～2μg/mL,兩性霉素B為16～0.03μg/mL。二甲基亞砜的終濃度低于1%。2.2代疾病的傳代培養(yǎng)2.2.1gl-7菌株的培養(yǎng)白色念珠菌C.albicans)(購(gòu)自中科院微生物所)。威可海姆原藻(P.wickerhamii),啤酒酵母GL-7(S.cerevisiaeGL-7)菌種由W.DavidNes(DepartmentofChemistryandBiochemistry,TexasTechUniversity,Lubock,Texas,USA)博士惠贈(zèng)。2.2.2糖酸糖凝膠電泳改良沙氏培養(yǎng)基(蛋白胨1%,葡萄糖2%);改良沙氏半固體培養(yǎng)基(蛋白胨1%,葡萄糖2%,瓊脂0.3%);YPG液體培養(yǎng)基(蛋白胨2%,葡萄糖2%,酵母提取物1%);YPG半固體培養(yǎng)基(蛋白胨2%,葡萄糖2%,酵母提取物1%,瓊脂0.3%)。2.2.3真菌作藥敏試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)菌株劃線接種培養(yǎng)后,挑選菌落接種于液體培養(yǎng)基中,白色念珠菌加入沙氏培養(yǎng)基,威克海姆原藻加入YPG培養(yǎng)基,啤酒酵母加入YPG培養(yǎng)基(加入1×10-5mg/L麥角甾醇),置入恒溫?fù)u床中(30℃,100r/min)培養(yǎng),取培養(yǎng)8h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的真菌作藥敏試驗(yàn)。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。2.3無(wú)菌試驗(yàn)2.3.1gl-1發(fā)酵試驗(yàn)半固體培養(yǎng)基以每管終體積1mL分裝于試管(13mm×100mm)中,在120℃、0.1Pa條件下滅菌20min。當(dāng)滅菌培養(yǎng)基冷卻至40℃～50℃時(shí),以無(wú)菌操作加入中藥DMSO溶液25μL,混勻制成斜面,同時(shí)用溶媒(2.5%MDSO)與蒸餾水作對(duì)照。取受試菌液劃線接種于斜面上。白色念珠菌終濃度1×103cfu/mL,威克海姆原藻與啤酒酵母GL-7終濃度2×104cfu/mL,放于30℃溫箱中于48h內(nèi)觀察菌生長(zhǎng)狀態(tài)。目測(cè)并以下列標(biāo)準(zhǔn)記錄:菌完全無(wú)生長(zhǎng)“-”;菌發(fā)育遲緩,形成的菌落較小“+”;菌發(fā)育不旺盛“++”;菌發(fā)育較旺盛,但菌落比正常較小“+++”;菌發(fā)育迅速旺盛“++++”。平均三次試驗(yàn)結(jié)果列于表1。本試驗(yàn)中共對(duì)164種單味藥和3個(gè)小復(fù)方(苦參+蛇床;艾葉+海桐皮;荊芥+生地)的乙醇提取物進(jìn)行了3種真菌的抗菌活性試驗(yàn)。對(duì)一種或幾種真菌具有較強(qiáng)抑制作用的藥物有:牡丹皮,土槿皮,知母,高良姜,黃連,丁香,肉桂,黃柏,黃芩,菖蒲,桂枝,五倍子,肉豆蔻,防己,地骨皮,青木香,萆?,木香,徐長(zhǎng)卿,丹參,鶴虱,急性子。在1mg/mL濃度,牡丹皮,土槿皮對(duì)3種真菌均有抑制作用。對(duì)白色念珠菌有抑制作用的有黃連,丁香,肉桂,知母,高良姜,桂枝,五倍子;對(duì)威克海姆原藻有抑制作用的有黃連,丁香,肉桂,肉豆蔻,青木香,菖蒲,防己,地骨皮,萆?;對(duì)GL-7有抑制作用的有知母,高良姜,青木香,萆?,木香。2.3.2抑菌活性測(cè)定96孔細(xì)胞培養(yǎng)板紫外線照射30min后,于每板第1排各孔(12孔)內(nèi)分別加入培養(yǎng)基180μL,第11孔為陰性對(duì)照,12孔為陽(yáng)性對(duì)照;系列稀釋濃度的待測(cè)藥液10μL依次加入相應(yīng)藥液于各孔中,陰性對(duì)照中加20μL,加入制備的真菌溶液10μL(陰性對(duì)照孔不加),使最終菌量為0.5×103～2.5×103cfu/mL,振蕩5min使各液充分混勻,35℃溫箱培養(yǎng)(濕盒內(nèi)保持液量)48h觀察。未見(jiàn)菌生長(zhǎng)的最低濃度為最低抑菌濃度(MIC),見(jiàn)表2。25個(gè)單體化合物中只有紫草素對(duì)酵母GL-7有特異性抑制作用,最低抑菌濃度為3.13μg/mL,檸檬醛對(duì)威克海姆原藻和啤酒酵母GL-7的最低抑菌濃度為250μg/mL,其他成分與對(duì)照藥兩性霉素B相比,無(wú)明顯的抗菌活性。3抑菌結(jié)果與其它檢測(cè)藥物的作用本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用體外半固體藥基法篩選抗真菌中藥,該方法簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì),是很便捷的初步篩選方法。抗真菌藥物篩選試驗(yàn)結(jié)果受外界的影響因素復(fù)雜,例如,藥物的種類(lèi),制備方法,藥物濃度,溶媒的選擇,試驗(yàn)菌的種類(lèi),菌種成熟的程度,菌孢子的濃度,培養(yǎng)的溫度及時(shí)間等。并且體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床應(yīng)用效果尚有差異。因此,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅僅是在一定條件下藥物與真菌作用的結(jié)果,它的陰性結(jié)果只說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)作用,而陽(yáng)性結(jié)果必須是在低濃度下有明顯作用的。在抑菌作用的估價(jià)中,我們不重視大于“++”的抑菌結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中中藥種類(lèi)較多,為求方法上的一致性,只應(yīng)用中藥的乙醇提取物,而未做其它提取方法的對(duì)比。由于提取溶劑不同使某些中藥抑菌結(jié)果與其它報(bào)道有顯著差異。例如,文獻(xiàn)中黃連的10%水煎劑對(duì)白色念珠菌無(wú)作用,血竭的水煎劑對(duì)白色念珠菌有一定的抑制作用,而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃連的乙醇提取物在1mg/mL濃度對(duì)白色念珠菌有抑制作用,而血竭的醇提物作用不明顯。曹仁烈報(bào)道土槿皮水提液無(wú)抑菌作用,而本實(shí)驗(yàn)中土槿皮乙醇提取物卻顯示強(qiáng)的抗真菌作用。說(shuō)明提取溶劑不同,提取出的有效成分不同,體現(xiàn)的藥效就不同。同一種藥物對(duì)不同菌株作用也不同,其中除牡丹皮,土槿皮對(duì)3種菌均有作用外,其它藥物只對(duì)其中的一種或兩種菌有作用,提示作用靶點(diǎn)可能不同。很多報(bào)道揮發(fā)油是抗真菌有效部位,例如肉桂,丁香,珊瑚姜等。本試驗(yàn)在藥物提取過(guò)程中,未單獨(dú)分離提取揮發(fā)油,并且在提取物的真空干燥過(guò)程中,揮發(fā)性物質(zhì)含量會(huì)受影響,也可能是影響藥效的原因之一。我們選取有效中藥的主要單體成分作抑菌實(shí)驗(yàn),與兩性霉素B相比,結(jié)果均不理想。肉桂醛的最低抑菌濃度與報(bào)道基本相同,丁香酚未表現(xiàn)出強(qiáng)的抗真菌作用,與宋軍的結(jié)果有明顯差異。紫草素對(duì)酵母GL-7有特異性抑制作用,最低抑菌濃度為3.13μg/mL,值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)選用的臨床常用的3個(gè)兩味藥組成的小復(fù)方,未表現(xiàn)出明顯的抑菌作用。曹松年等研究中藥復(fù)方的水煎劑對(duì)皮膚癬菌抑制作用,認(rèn)為復(fù)方的抑菌作用不及單味藥強(qiáng)。因?yàn)橹兴幍目拐婢行С煞峙c機(jī)制的多樣性,復(fù)方的研究就更為復(fù)雜。還有報(bào)道復(fù)方并不是通過(guò)直接抑菌而起作用,可能是通過(guò)增強(qiáng)肌體免疫力而抗真菌。尚有待進(jìn)一步探討。由于中藥粗提物中含有多種化學(xué)成分,成分與藥理作用復(fù)雜,并且受多種因素影響。目前的研究大多處于初步階段,篩選抗菌譜,通過(guò)掃描,透射電鏡觀察形態(tài)變化,缺乏對(duì)于作用機(jī)