一測多評法在淫羊藿中的方法學考察

一測多評法在淫羊藿中的方法學考察

綿羊：男性植物小科祥、箭葉關鍵詞：sagistatum、柔軟的頭發(fā)、菖蒲、山西人、流行性感冒、日本電視臺的干燥區(qū)域。其具有補腎陽,強筋骨,祛風濕。用于陽痿遺精,筋骨痿軟,風濕痹痛,麻木拘攣;更年期高血壓。目前已有同時測定淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷這4個指標成分含量的報道,但這些方法難以在實際工作中廣泛應用,其主要原因是由于一些對照品(如朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)價格昂貴且難以獲得,這直接限制了用常規(guī)的外標法或內標法實現(xiàn)其多指標質量控制的設想。在對成分復雜的中藥進行質量評價的過程中,由于中藥成分之間具有相互協(xié)同作用的特點以及先進分析技術的廣泛應用,選擇單一成分進行質量評價的傳統(tǒng)方法已經逐漸被同時測定多種有效成分的方法所取代,“一測多評”的研究思路已經在木通、人參、黃芪、梔子等藥材中得到驗證,本文將一測多評法應用于淫羊藿藥材的質量控制,實現(xiàn)其多成分的同步測定。1儀器與試藥JASCOPU-980高效液相色譜儀(JASCO日本分光公司),JASCOUV-925紫外-可見光檢測器,ANASTAR色譜工作站;Shimadzu高效液相色譜儀(日本島津公司),SPD-10Avp紫外檢測器,ANASTAR色譜工作站;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。12批淫羊藿藥材分別購自青海、新疆、吉林、四川等地。樣品經沈陽藥科大學中藥學院孫啟時教授鑒定,購自上海和湖南的藥材為柔毛淫羊藿E.pubescens,購自湖北的藥材為巫山淫羊藿E.wushanense,其余均為朝鮮淫羊藿E.koreanum。朝藿定A(批號A0228)、朝藿定B(批號A0229)、朝藿定C(批號A0230)對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司,HPLC(峰面積歸一化法)純度≥98%,淫羊藿苷(批號110737-200312)購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈(批號100108),色譜純,天津市康科德科技有限公司,水為實驗室自制重蒸水,其余試劑均為分析純。2方法與結果2.1方法原理一測多評法(Quantitativeanalysismulti-componentsbysinglemarker,QAMS)是指在多指標質量評價時,以藥材中某一典型組分(有對照品供應者)為內標,建立該組分與其他組分之間的相對校正因子,通過校正因子計算其他組分的含量。fkm=fk/fm=Wk×Am/Wm×AkAk為內標物峰面積,Wk為內標物濃度,Am為其他組分m峰面積;Wm為其他組分m濃度。2.2一測多評方法學考察2.2.1色譜條件DiamonsilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相乙腈-水(25∶75),柱溫30℃;流速1.0mL·min-1,檢測波長為270nm,見圖1。2.2.2對照品溶液的制備取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品適量,精密稱定,加甲醇配置成濃度分別為66.7,102,40.8,188mg·L-1的儲備液。另取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品適量,精密稱定,用甲醇溶解,配置成0.115,0.299,0.328,0.250g·L-1的混和標準溶液,保存于4℃冰箱中,備用。2.2.3供試品溶液的制備取淫羊藿藥材粉末(過60目篩)1g,精密稱定,至于100mL具塞錐形瓶中,精密量取20mL50%乙醇加入,稱重,超聲20min(140W,頻率40kHz),再稱重,以50%乙醇補足重量,離心(13000r·min-1,10min),經0.45μm微孔濾膜過濾,10μL進樣。2.2.4線性關系考察分別精密量取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷混合標準溶液1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0mL,置10mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻。分別精密吸取上述混合對照品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件測定,記錄峰面積。以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理,得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的標準曲線,見表1,各標準曲線在線性范圍內線性良好。2.2.5校正因子的計算在上述色譜條件下,分別測定不同進樣體積時,以淫羊藿苷(Icarrin,簡稱i)為內標,朝藿定A(epimedinA,簡稱A)、朝藿定B(epimedinB,簡稱B)、朝藿定C(epimedinC,簡稱C)的相對校正因子f,見表2。2.2.6精密度試驗精密吸取同一供試品溶液10μL連續(xù)進樣6次,記錄朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的峰面積,得出日內精密度分別為2.1%,2.2%,2.3%和1.2%;連續(xù)進樣3d,每天6次,記錄峰面積,以上4種指標成分日間精密度分別為2.4%,1.2%,2.2%,1.4%。2.2.7供試品溶液穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液(吉林),分別于0,2,4,8,12,24h,注入高效液相色譜儀,依法測定,記錄峰面積,得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷穩(wěn)定性的RSD分別為2.2%,1.2%,2.6%,1.3%。表明處理后的樣品在1d內穩(wěn)定。2.2.8重復性試驗按上述供試品溶液制備方法,稱取同一批淫羊藿藥材粉末(吉林)約1g,共6份,分別進行測定,測得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的平均含量分別為0.467,0.797,0.467,1.691μg·g-1,RSD分別為2.1%,2.1%,2.2%,1.1%。2.2.9回收率試驗采取加樣回收率法(按1∶1加入),取同一批已知含量的淫羊藿藥材粉末(吉林)約0.5g,6份,精密稱定,分別精密加入一定量的2.2.2項下朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品溶液,按2.2.3項下方法制備供試品溶液,精密吸取上述供試品溶液10μL,依法測定,計算回收率,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的加樣回收率分別為97.6%,99.5%,100.1%,97.4%,RSD分別為2.8%,1.8%,2.2%,2.1%。2.3校正因子的重現(xiàn)性考察2.3.1色譜柱及高效液相色譜儀考察精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液1,2,4,6,8,10μL,進樣分析,按2.1項下方法計算試驗考察了Shimadazu,JASCO兩種高效液相色譜系統(tǒng)和DiamonsilC18(4μm×250mm,5μm),EliteHypersilDBS(4μm×250mm,5μm),PhemomenexGeminiC18(4μm×250mm,5μm)3種色譜柱,見表3。2.3.2待測組分色譜峰的定位在只使用一個對照品時,如何正確指認藥材中其他3個待測成分是一個必須解決的問題。本文采用相對保留值α(待測成分與內標調整保留時間之比)作為定位標準,并在不同品牌高效液相色譜系統(tǒng)和不同色譜柱下對此參數(shù)進行考察,見表4,各成分的相對保留值α波動較小,RSD≤5%,表明利用α值進行峰的定位是可行的。2.4淫羊藿藥材含量測定一測多評法與常規(guī)法的結果比較分別稱取淫羊藿藥材粉末(過60目篩)約1.0g(n=3),精密稱定,按2.2.3項下方法制備各供試品溶液,精密吸取各供試品溶液10μL,注入高效液相色譜儀,依法測定。采用外標法和一測多評法計算不同產地及不同種類的淫羊藿藥材中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量,見表5。常規(guī)的外標法實測含量值與一測多評計算的含量值經t檢驗比較,P>0.05,表明2種方法測得結果沒有顯著性差異。由此說明一測多評法可用于淫羊藿藥材的多成分質量評價研究。3討論在查閱文獻、借鑒前人研究結果的基礎上,本試驗分別考察了20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%乙醇8種提取溶劑,超聲、回流不同提取方法,發(fā)現(xiàn)采用20mL50%乙醇超聲20min提取,能夠兼顧上述4種黃酮類成分,得到滿意的提取率,且方法簡單,故選用50%乙醇超聲20min作為本試驗的提取條件。本實驗選用淫羊藿苷作為內標進行QAMS(一測多評法)是由于淫羊藿苷為淫羊藿中主要有效成分,且該對照品價廉易得。針對只使用單個對照品如何正確定位淫羊藿藥材中其余3個目標色譜峰的問題,本文引入了相對保留值α這種參數(shù)作為定位標準,并考察了3根不同品牌的色譜柱和兩種高效液相色譜系統(tǒng),比較結果顯示,采用相對保留值更能夠準確定位上述目標色譜峰。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷是淫羊