乳腺癌干細胞研究進展

乳腺癌干細胞研究進展

乳腺癌是女性最常見的腫瘤。約有50%的乳腺癌患者經手術治療后可治愈,其他患者在治療后5年內出現(xiàn)復發(fā)及轉移而導致治療失敗,且復發(fā)及轉移是導致患者死亡的主要原因。隨著人們對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機制的深入研究,乳腺癌干細胞日益受到重視。1乳腺癌中細胞的分化腫瘤干細胞學說認為,腫瘤組織中的癌細胞的生物學特性不盡相同,即腫瘤組織內的細胞本身具有異質性,其中一小群細胞數目極其稀少,分化緩慢,但其成瘤能力較強,多具有與干細胞相似的自我更新能力和一定的分化潛能,并表達某些正常干細胞相同的細胞標記蛋白。同樣,乳腺癌中也存在著此類細胞,即所謂的乳腺癌干細胞(breastcancerstemcells,BCSCs),BCSCs被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展與維持的基礎,與腫瘤的復發(fā)、轉移和對治療的耐受有關。目前研究認為只有少數BCSCs進入細胞周期,而多數BCSCs處于靜止狀態(tài),故BCSCs對常規(guī)的化療藥物并不敏感?，F(xiàn)有的物理、化學藥物治療手段所針對的是大多數的腫瘤細胞,對腫瘤中少數的BCSCs無法達到最有效的殺滅效果,不能防止惡性腫瘤的復發(fā)及轉移,而腫瘤的復發(fā)與轉移是患者死亡的主要原因。2乳腺癌的樹干標記和高發(fā)現(xiàn)2.1乳腺癌細胞體外培養(yǎng)乳腺癌中以CD44+CD24-/low為分子標志物的細胞為乳腺癌干細胞(breastcancerinitiatingcells,BRCaIC)。Clarke等首次從人類乳腺癌標本中分離出BRCaIC,并把表達CD44、B38.1和ESA的乳腺癌細胞移植到NOD/scid小鼠體內并生成腫瘤。Al-Hajj等以LinESA+CD44+CD24-/low為特異性乳腺癌干細胞,證明了表型為Lin-ESA+CD44+CD24-/low的細胞較表型為Lin-ESA-CD44+CD24+的細胞在NOD/scid小鼠體內具有更強的成瘤能力。Ponti等把乳腺癌組織和乳腺癌的細胞系中分離出的CD4+CD24-CD43-進行體外培養(yǎng),結果顯示細胞呈球狀生長,并過表達血管生成因子、細胞保護因子及公認的干細胞標志物Oct4。但Abraham等用免疫雙染法檢測了136例患者石蠟組織切片,發(fā)現(xiàn)CD44+CD24-/low的比例與臨床結果無關,CD44+CD24-/low比例高的乳腺癌更傾向于骨轉移,提示對BRCaIC的標志尚需進一步細化及深入研究。2.2wnt信號通路活化劑有證據表明與乳腺癌形成有關的信號通路,如Notch、Shh和Wnt、Hedgehog參與了調整乳腺癌干細胞自我更新的過程。乳腺干細胞高表達Notch1、Notch4及其靶基因HESR-1,Notch通路的活化導致了乳腺微球體的形成,卻對分化細胞無作用。Wnt蛋白是細胞間的信號分子,正常情況下,該分子調節(jié)一些器官的發(fā)育,其異常調節(jié)時則導致腫瘤發(fā)生。研究表明,Wnt信號通路的活化可引起乳腺癌干細胞的比例增加,骨髓中Wnt表達可能同樣影響HSCs,使用高度純化的小鼠骨髓HSCs。在長期的HSCs培養(yǎng)中,激活β-catenin的過度表達(一種Wnt的下游激活物)能擴增可移植的HSCs。Liu等研究發(fā)現(xiàn),Hedgehog在乳腺癌干細胞高度表達,其通道活化后乳腺微球體數量及體積均增加,同樣提示Hedgehog異常表達可導致乳腺癌的形成。2.3循環(huán)祖細胞鑒定ALDH1是細胞內乙醛氧化脫氫酶,可在干細胞分化早期氧化視黃醇而形成視黃酸,鼠和人類的造血及神經干細胞中ALDH1活性較高,Hoechst染色法和ALDH活性已被用來純化和鑒定鼠和人的造血干細胞。此外,循環(huán)祖細胞也可用ALDH活性來鑒定。另一研究顯示ALDH1的表達可能提示乳腺上皮細胞具有干細胞特征。Ginestier等發(fā)現(xiàn)ALDH1活性增加的正常人和癌癥患者的乳腺上皮細胞具有干/祖細胞特性。含有高水平的ALDH1的正常乳腺上皮細胞群能形成乳腺球,從中分離的細胞能自我更新。ALDH1高活性的乳腺癌細胞可以重現(xiàn)親代腫瘤的雜合性,表明ALDH1高活性的乳腺癌細胞也包含干細胞群。Ginestier等還認為ALDH1免疫組織化學檢測可用來鑒別乳腺干細胞。ALDH1陽性細胞定位于末端導管小葉單位。另一研究認為乳腺癌干細胞定位于乳腺導管。在乳腺癌臨床檢測中ALDH1的表達與預后有關。3乳腺癌干預的分離和發(fā)現(xiàn)3.1aldh+的臨床意義乳腺癌干細胞的成功分離是為下一步進行乳腺癌干細胞特性研究的關鍵步驟。研究者采用各種不同途徑來分離乳腺癌干細胞,每種方法各有其利弊。目前比較成熟的方法有2種:流式分選法(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)和磁式分選法(magneticactivatedcellsorting,MACS)。最近有研究中發(fā)現(xiàn),高ALDH活性的正常乳腺上皮細胞具有干細胞的特性,可在NOD/scid小鼠體內形成乳球和導管小葉結構。在人類乳腺癌的異種移植中,ALDH+的細胞也具有腫瘤干細胞的特征:約占細胞總數的1%~10%,致瘤性很強,200個ALDH+的細胞即可在NOD/scid小鼠體內形成腫瘤,且新形成的轉移瘤中具有與原發(fā)腫瘤相同的ALDH基因表達圖譜,但2×103個ALDH-細胞也不能形成轉移瘤。此外,利用腫瘤組織的微陣列分析也發(fā)現(xiàn)ALDH+的乳腺癌臨床預后差。目前臨床上使用測定ALDH的活性為乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)提供有力支持。3.1.2吸附細胞后的磁場MACS利用未標記的CD分子的單克隆抗體作為一抗與單細胞懸液溫育后,再與免疫磁珠標記的二抗結合,當這種特異性一抗、二抗標記的細胞懸液流過特制的永久磁鐵的磁場時,可吸附在磁式分選柱內,再將磁式分選柱移開磁場并從柱內洗脫,從而收集干細胞。3.2乳腺癌干預的發(fā)現(xiàn)當前,從形態(tài)學方面對乳腺癌干細胞進行鑒定較為困難,只能從功能學方面進行分析。3.2.1乳腺癌胞菌體的增殖能力即體外培養(yǎng)的乳腺癌干細胞是否呈懸浮球狀生長,是否具有自我更新和增殖能力以及是否具多向分化潛能。目前有研究表明:乳腺癌干細胞易呈懸浮球狀生長并可連續(xù)傳代,在傳代的后期更易出現(xiàn)懸浮球狀生長且增殖速度加快;此外,通過有限稀釋實驗和亞克隆培養(yǎng)分析發(fā)現(xiàn)所有親本腫瘤球制成的細胞懸液都再次形成腫瘤球,且與親本腫瘤球完全相同,提示乳腺癌干細胞具有自我更新和增殖能力;將乳腺癌干細胞轉移至含血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)7d左右,便不再或極少表達Nestin和CD133,而這2種標記物現(xiàn)在普遍被認為在干細胞或是祖細胞中表達,表明了干細胞具有多向分化的潛能。但這些方法只能初步鑒定乳腺癌干細胞。3.2.2小鼠體內重建模型即將初步鑒定出的乳腺癌干細胞在NOD/scid小鼠體內重建模型,從而觀察其致瘤性,此種方法被認為是目前進行腫瘤干細胞鑒定的最具說服力的方法。3.2.3乳腺癌細胞的免疫療法美國密歇根大學綜合癌癥中心的研究人員最近又發(fā)現(xiàn)一種鑒定乳腺腫瘤干細胞新方法,這項發(fā)現(xiàn)不僅為確定乳腺癌治療最佳方案提供了一種簡單診斷方法,還強有力地支持了癌癥干細胞學說。研究人員利用名為ALDEFLUOR的試劑來檢測細胞中的ALDH活性。表達高水平ALDH的細胞會發(fā)出熒光并且能夠被檢測到。隨后,細胞被分選并與被染色細胞分離。在此過程中,研究人員發(fā)現(xiàn)ALDEFLUOR試劑檢測陽性細胞的行為與干細胞相同,而檢測結果為陰性細胞則明顯不同。4乳腺癌干細胞在乳腺癌治療中的應用現(xiàn)有的乳腺癌治療方法多旨在盡可能殺死或清除一切腫瘤細胞。但是對存在于腫瘤中的數量稀少的干細胞樣細胞群卻作用甚微,治療后殘存腫瘤干細胞的增殖,足以促使腫瘤復發(fā)和轉移。乳腺癌復發(fā)被認為是由于非分裂的乳腺癌干細胞具有抗藥性。比如,大多數與BRCA21基因相關的乳腺癌在解除鉑類化療藥物治療2~3個月后獲得抗鉑性。對這些腫瘤細胞分析發(fā)現(xiàn),與原發(fā)性腫瘤移植相比,CD29highCD-24med細胞群在鉑類藥物難治性繼發(fā)腫瘤移植中顯著增加,從6.6%~11.0%增加至16.5%~29.2%。這表明克隆演變和乳腺癌干細胞擴增可能是化療耐藥的一個原因。免疫療法是另一種用來消除乳腺癌干細胞群的治療方法。Li等研究顯示添加突變rh471TNF2α到MCF7亞群(乳腺癌干細胞標記陽性)可促進細胞凋亡和降低自我更新的能力。突變rh471TNF2α可負性調節(jié)乳腺癌干細胞,也有可能被應用于乳腺癌治療。Piyush等發(fā)現(xiàn)鹽霉素殺死乳腺癌干細胞的能力比普通的化療藥物如紫杉醇強100倍。與被紫杉醇處理過的腫瘤干細胞相比,經過鹽霉素處理過的腫瘤干細胞被注入到實驗鼠體內后,成瘤幾率顯著降低,且實驗鼠腫瘤的生長速度也明顯減慢。5特異性乳腺癌干細胞總之,乳腺癌干細胞理論為根治乳腺癌開辟了新的治療途徑,腫瘤治療研究開始以特異性乳腺癌干細胞為主要目標,即從源頭上根治腫瘤。發(fā)現(xiàn)和闡明乳腺癌干細胞增殖過程中的基因調控機理,將為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的靶點,針對乳腺癌干細胞的新一代特異性強的抗腫瘤生物及免疫藥物有望極大地提高腫瘤的治療效果。3.1.1FACS3.1.1.er2,abcg2基因的表達三磷酸腺苷結合盒轉運體(ATP-bindingcassettesuperfamilyGmember2,ABCG2),基因在多種來源的干細胞膜均有表達,而在大多數成熟細胞中不表達。在乳腺癌干細胞中同樣高表達ABCG2,其高表達細胞高效外排DNA熒光染料Hoechst33342,從而能用流式分選出側群(sidepopulation,SP)干細胞。Patrawala等利用此法成功分離出乳腺癌干細胞。3.1.1.小鼠乳腺癌中cd49和cd2的分離純化乳腺癌干細胞可利用CD44和CD24分子來分選,