脂多糖對hepg2細胞胰島素抵抗的影響

脂多糖對hepg2細胞胰島素抵抗的影響

通過大量的研究和實驗，證實胰島素抵抗（ir）與腸內(nèi)毒素血癥（iet）和非酒精內(nèi)毒素血癥（nad）密切相關(guān)。它是nad形成和發(fā)展的重要標志。人肝癌細胞株HepG2細胞是一種表型與肝細胞極為相似的人肝胚胎瘤細胞株,保留了肝細胞的許多生物學特性。其表面表達高親和力的胰島素受體,受體數(shù)目受胰島素水平的調(diào)節(jié),當胰島素受體數(shù)目下調(diào)至一定的程度時,則該細胞對胰島素的作用產(chǎn)生抵抗,其程度與胰島素水平及刺激持續(xù)的時間呈正相關(guān)。本實驗?zāi)M機體IR的發(fā)病機制和病理學特點,用生理和超生理濃度的胰島素刺激HepG2細胞,觀察HepG2細胞葡萄糖攝取和糖原等的變化,建立IR模型,并模擬體內(nèi)IETM形成的特點,少量多次給予脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激,觀察IR與IETM對肝細胞的影響。1材料和方法1.1材料和試劑HepG2細胞株購自中國科學院上海細胞所,本實驗室自行保存?zhèn)鞔鷤溆?。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶、胰島素、二甲基亞砜(DMSO)、細胞松弛素B(cytochalasinB)均購自Sigma公司;甘氨酸、牛血清白蛋白(BSA)均購自Amresco公司;LPS(E.coliB5:055)購自Sigma公司;3H-2脫氧葡萄糖(3H-DG)購自北京原子高科核技術(shù)股份有限公司;閃爍純(POPOP)、閃爍體(PPO)購自上海試劑一廠;糖原試劑盒購自南京建成生物工程研究所第一分所。1.2葡萄糖消耗量測定HepG2細胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液)于37℃,5%CO2條件下無菌培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞移至96孔板中用于實驗,待細胞長至80%～90%融合后,更換無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育12h。不鋪細胞的空白孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)液;其余各孔則加入無血清的含胰島素培養(yǎng)液及終濃度分別為5×10-5、5×10-6、5×10-7、5×10-8、5×10-9mol/L的胰島素。孵育24h后,用葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)液上清的葡萄糖含量。以空白孔為對照,計算24h葡萄糖消耗量。每組9孔,實驗重復3次,每孔數(shù)值取平均值。根據(jù)所得結(jié)果,選取形成IR的最佳胰島素濃度,并觀察胰島素不同的作用時間對HepG2細胞IR的影響。1.3分組、培養(yǎng)和給藥HepG2細胞以基礎(chǔ)培養(yǎng)液于37℃,5%CO2條件下無菌培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞改用含0.5%BSA的低糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)12h后,細胞分為對照組、模型組、脂多糖組、模型加脂多糖組培養(yǎng)24h。其中對照組仍用基礎(chǔ)培養(yǎng)液,模型組換用含5×10-7mol/L胰島素的培養(yǎng)液,脂多糖組在培養(yǎng)全過程中基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)分別于0、6、12、18h加入1mg/LLPS(共4mg/L),模型加脂多糖組換用脂多糖組的培養(yǎng)液,同時加入終濃度為5×10-7mol/L的胰島素,每組9孔。實驗重復3次,每孔數(shù)值取平均值。1.4各組細胞總蛋白的含量細胞每組設(shè)平行孔9個,于96孔板培養(yǎng)24h后Braford微量法檢測各組細胞總蛋白的含量。吸取培養(yǎng)24h后的各組細胞培養(yǎng)液,蒽酮法檢測細胞內(nèi)糖原含量。計算公式如下:糖原含量=[樣品光密度值/標準光密度值×標準品糖原含量(mg×10-2)]/蛋白含量(mg)。實驗重復3次,每孔數(shù)值取平均值。1.5處理及研磨法制備細胞爬片,采用PAS染色法進行糖原染色。具體步驟為:取各組細胞爬片,95%乙醇固定10min,蒸餾水洗3次;TritonX-100作用15min,蒸餾水洗3次;1%高碘酸水溶液15min,蒸餾水洗3次;Schiff液30min,偏亞硫酸鈉水溶液洗3次,每次3min,蒸餾水洗數(shù)次;Harris氏蘇木素復染片刻,蒸餾水洗3次;鹽酸酒精1min,自來水洗返藍;濃度遞增的乙醇梯度脫水,二甲苯透明,樹膠封固于載玻片上。顯微鏡下觀察,拍攝照片。1.6基礎(chǔ)特異性轉(zhuǎn)運與胰島素刺激活性的檢測參照文獻方法檢測各組細胞對葡萄糖的攝取。具體方法為:分組加藥后以含0.5%BSA的低糖DMEM37℃孵育2h,制備細胞懸液按組轉(zhuǎn)入各反應(yīng)管中。每樣品制備4個反應(yīng)管,分別測定基礎(chǔ)狀態(tài)(無胰島素刺激,加/不加細胞松弛素B)和胰島素刺激下(加/不加細胞松弛素B)的細胞對葡萄糖的攝取。向試管中加入含0.1%BSA的KRHB作為胰島素的對照或200nmol/L胰島素各50μL;同時為測定細胞表面或細胞間隙中葡萄糖非特異轉(zhuǎn)運,另要立即加終濃度為5μmol/L的細胞松弛素B2μL,以防止葡萄糖向細胞內(nèi)彌散,對照管加10%乙醇2μL;加入4μCi/mL的3H-DG50μL,使反應(yīng)體系總放射量為0.2μCi,總體積為152μL,37℃搖動水浴15min后加入預(yù)冷的KRHB終止反應(yīng)。將試管用預(yù)冷的KRHB洗滌,3000r/min離心7mim吸棄上清,重復3次;加入裂解液0.1%SDS0.2mL混勻,加入12mL閃爍液,避光放置12h,用液閃譜儀計數(shù)其每分鐘衰變值(單位為cpm)。每樣品重復檢測3次,取平均值。按如下公式計算得到基礎(chǔ)特異性轉(zhuǎn)運或胰島素刺激的特異性轉(zhuǎn)運的放射活性,再用與對照組的比例來表示。特異性轉(zhuǎn)運=總放射活性(不加細胞松弛素B)-非特異性放射活性(加細胞松弛素B)。1.7組患者獨立樣本t檢驗、多組間比較所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(xˉ±sxˉ±s)表示。2組間比較用獨立樣本t檢驗,多組間比較用單因素方差分析,P<0.05為差異有顯著性。使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。2結(jié)果2.1不同菌株對葡萄糖的汲取實驗與對照組比較,模型組的胰島素濃度由5×10-9mol/L增加到5×10-5mol/L時,模型組對葡萄糖的攝取逐漸減少,使培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗量逐漸降低,5×10-7mol/L時達到最小(P<0.01),結(jié)果見表1。2.2胰島素作用時間在5×10-7mol/L的胰島素不同作用時間內(nèi),隨著胰島素作用時間的延長,模型組對葡萄糖的攝取均比對照組低,胰島素抵抗狀態(tài)則從24h開始持續(xù)到48h,統(tǒng)計學處理差異均具有顯著性(P<0.01),結(jié)果見表2。2.3組患者的基礎(chǔ)特異性轉(zhuǎn)運情況脂多糖組與對照組相比,無論是基礎(chǔ)特異性轉(zhuǎn)運,還是胰島素刺激的特異性轉(zhuǎn)運均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。模型加脂多糖組的基礎(chǔ)特異性轉(zhuǎn)運比對照組明顯降低(P<0.01);胰島素刺激的特異性轉(zhuǎn)運不僅比對照組低(P<0.01),而且比模型組低(P<0.01),結(jié)果見表3。2.4比較兩組患者的統(tǒng)計學特征脂多糖組培養(yǎng)液內(nèi)的糖原含量與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05);模型加脂多糖組與對照組相比明顯下降,有統(tǒng)計學差異(P<0.01),結(jié)果見表4。2.5脂多糖對糖原顆粒的影響PAS染色觀察,各組細胞胞漿內(nèi)紅色的糖原顆粒,脂多糖組與對照組比仍然較多,而模型加脂多糖組的糖原顆粒與模型組相比更為少見,見圖1(彩圖見插頁2)。3復方中藥降脂平肝湯對大鼠肝臟作用的模擬胰島素刺激的葡萄糖攝取障礙是IR的主要特征,利用細胞對同位素標記的葡萄糖攝取實驗,可以準確地評價細胞對胰島素刺激的葡萄糖攝取和利用能力,即胰島素的敏感性,從而判斷是否存在IR。本實驗采用3H-DG轉(zhuǎn)運的測定方法,通過加入細胞松弛素B作為對照,去除了葡萄糖非特異轉(zhuǎn)運的因素,所得結(jié)果為葡萄糖的特異性轉(zhuǎn)運,因此,本實驗采用的是公認的鑒定細胞水平IR的特異性方法。本實驗以5×10-7mol/L的胰島素作用于HepG2細胞24h成功復制胰島素抵抗模型,適用于胰島素相關(guān)機制的研究。研究表明,脂肪肝的發(fā)生發(fā)展與IETM和IR均密切相關(guān)。肝臟是體內(nèi)清除內(nèi)毒素和解毒的主要臟器,也是遭受內(nèi)毒素攻擊的首要器官。因此,抑制IETM,控制IR可能是防治脂肪肝并阻止其繼續(xù)進展的有效措施。本實驗?zāi)M體內(nèi)IETM形成的特點,少量多次給予LPS直接作用于肝細胞,對HepG2細胞IR的發(fā)生作用并不明顯,而當以上刺激作用于同時給予高胰島素刺激產(chǎn)生IR的HepG2細胞時,細胞發(fā)生的IR比單純高胰島素刺激更為強烈,提示IETM可加重HepG2細胞的IR,脂多糖是脂肪肝發(fā)病的觸發(fā)因子。脂肪肝屬中醫(yī)“痰濁”“肥胖”“積聚”“濕阻”等范疇,本病的基本病機為痰瘀互結(jié),多因過食肥甘厚味,脾失健運,致使脾虛濕阻、痰濁瘀血互結(jié),痹阻肝臟脈絡(luò)而成,故應(yīng)以健脾化痰利濕、活血化瘀、通腑降濁為治療原則。筆者前期的臨床和動物實驗研究已經(jīng)證實復方中藥降脂平肝湯具有防治脂肪肝的作用。本方采用