高濃啤酒釀造過程中常見的問題

高濃啤酒釀造過程中常見的問題

酒果酸酶的過程是一種復(fù)雜的生化反應(yīng)過程。在這一過程中，葡萄糖的釋放環(huán)境不斷變化，如碳源、氮源和溶氧消耗、溶血、乙醇濃度和溫度的變化等。酵母細(xì)胞通過調(diào)控胞內(nèi)的代謝情況能夠快速的適應(yīng)這些環(huán)境條件的變化,但是環(huán)境條件的變化超出了酵母細(xì)胞的適應(yīng)范圍,就會(huì)對(duì)酵母的生理活性產(chǎn)生諸多不利的影響。在高濃釀造(>15°P)過程中由于麥汁中高濃度可發(fā)酵性糖(麥芽糖、麥芽三糖和葡萄糖)的存在,發(fā)酵初期發(fā)酵液的滲透壓較高,導(dǎo)致發(fā)酵后期乙醇濃度較高。這些環(huán)境壓力都會(huì)給酵母細(xì)胞內(nèi)的代謝反應(yīng)帶來不利的影響。自1970年代美國和加拿大等國將高濃釀造技術(shù)應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)工業(yè)中之后,國外學(xué)者就高濃釀造技術(shù)對(duì)酵母代謝的影響進(jìn)行了大量研究,而國內(nèi)的研究報(bào)道很少。這些研究主要集中在碳源物質(zhì)(麥汁中可發(fā)酵性糖和儲(chǔ)藏性糖等)的代謝、氮源物質(zhì)(氨基酸和蛋白酶A等)的代謝、風(fēng)味物質(zhì)(酯類和高級(jí)醇類等)的代謝和能源物質(zhì)(ATP、ADP和AMP等)的代謝等方面。目前,國內(nèi)外已有多位學(xué)者對(duì)啤酒高濃釀造技術(shù)進(jìn)行了較全面的綜述,但針對(duì)酵母代謝情況的影響還缺乏系統(tǒng)的分析,而這些正是深入了解和把握高濃釀造技術(shù)的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)。1高濃度處理對(duì)葡萄酸鈉水源的影響1.1麥汁對(duì)酵母降糖的影響在高濃釀造過程中,隨著麥汁濃度升高,麥汁和發(fā)酵液的滲透壓相應(yīng)升高,乙醇產(chǎn)量也相應(yīng)增加(見表1),滲透壓升高使環(huán)境中的水對(duì)細(xì)胞的可給性降低,形成一定程度的生理干燥,并且乙醇濃度過高對(duì)酵母也產(chǎn)生一定的毒害作用,因此酵母生理活性降低,降糖速率也隨之降低,使發(fā)酵周期延長。Suihko等研究了發(fā)酵溫度為10℃時(shí),不同濃度麥汁對(duì)酵母降糖的影響,當(dāng)表觀發(fā)酵度達(dá)到80%時(shí),12、16、20°P和23°P麥汁的發(fā)酵周期分別為5、6、9d和14d,麥汁濃度增加使發(fā)酵周期延長。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)(圖1),在發(fā)酵的前4天,麥汁濃度升高對(duì)酵母降糖的影響并不顯著,繼續(xù)發(fā)酵,乙醇濃度和滲透壓進(jìn)一步升高,酵母的生理活性降低,降糖速率變慢,麥汁濃度越高,在發(fā)酵后期對(duì)酵母降糖的影響越大,從而使發(fā)酵周期延長。1.2麥芽糖代謝活性的變化在工業(yè)化生產(chǎn)中,有很多企業(yè)使用糖漿來提高麥汁濃度進(jìn)行高濃釀造,研究表明,糖漿中糖組分之間比例的改變,可能會(huì)導(dǎo)致高濃麥汁中糖組分的較大波動(dòng),因此這個(gè)比例對(duì)釀酒酵母利用糖類物質(zhì)具有重要影響。Rautio等研究發(fā)現(xiàn),在高葡萄糖麥汁(100g麥芽糖/L和55g葡萄糖/L,麥芽糖∶葡萄糖=1.8∶1)中,發(fā)酵前20h,Ale和Lager酵母菌的麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性受到顯著的抑制。提高麥芽糖和葡萄糖比例(120g麥芽糖/L和25g葡萄糖/L,麥芽糖∶葡糖糖=4.8∶1),在24°P高濃麥汁中,麥芽糖代謝基因(MALx1,MALx2和MTT1)在葡萄糖濃度大于20g/L時(shí)表達(dá)率開始增加,同時(shí)麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性也相應(yīng)增加,說明葡萄糖未對(duì)麥芽糖代謝產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)發(fā)酵50h時(shí),麥芽糖和麥芽三糖的濃度分別為90g/L和35g/L,但麥芽糖代謝基因的表達(dá)量已迅速降低為最大表達(dá)率的20%,這可能是由于在高麥芽糖濃度的麥汁中,組蛋白甲基化對(duì)麥芽糖代謝基因產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制作用。由此可知,高濃釀造麥汁的麥芽糖和葡萄糖的比例過高或過低都對(duì)酵母利用糖類物質(zhì)產(chǎn)生不利的影響,因此確定合適的麥芽糖和葡萄糖比例及其酵母代謝機(jī)理是今后研究的重要方向。1.3麥汁濃度對(duì)lager酵母菌糖原和海藻糖濃度的影響酵母糖原是由D-葡萄糖聚合而成的支鏈聚合物,經(jīng)過磷酸化和水解后,以葡萄糖單元被酵母吸收利用,胞內(nèi)海藻糖是一種由D-葡萄糖組成的非還原性二糖,其發(fā)酵速度比胞外糖還快。糖原和海藻糖是酵母細(xì)胞內(nèi)重要的碳水化合物,它們的最大含量約占細(xì)胞干重的1/4,是酵母細(xì)胞的重要儲(chǔ)能物質(zhì),也是酵母細(xì)胞耐受極端環(huán)境(高滲透壓、高酒精濃度和低溶氧)的重要指標(biāo)。酵母細(xì)胞內(nèi)糖原和海藻糖濃度隨麥汁濃度升高而升高。在正常濃度的麥汁(12°P)中,Lager酵母菌中的海藻糖濃度較低,是干細(xì)胞的1.5%,當(dāng)麥汁濃度升高到18°P時(shí),胞內(nèi)海藻糖濃度增加到細(xì)胞干重的14%。Lies等篩選得到高濃釀造優(yōu)良酵母菌GT336,在23°P高濃麥汁中其胞內(nèi)糖原和海藻糖濃度比出發(fā)菌株CMBS33顯著降低,有效的增加了乙醇的轉(zhuǎn)化率。1.4麥汁對(duì)酵母細(xì)胞活性的影響酵母將麥汁中的可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化生成乙醇,隨著麥汁濃度的增加乙醇濃度也隨之升高,但濃度過高(>24°P)麥汁發(fā)酵不完全,最終的乙醇濃度反而降低(表2)。由表2知,麥汁濃度在22-24°P時(shí),與其他濃度的麥汁相比乙醇的最終濃度、最大生成速率和比生成率都較大,說明麥汁在此濃度范圍內(nèi)有利于乙醇的生成,但乙醇濃度過高又會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,細(xì)胞活性隨著乙醇濃度升高而降低。原因是由于高濃度的乙醇通過對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生作用,細(xì)胞膜的透性和構(gòu)造便發(fā)生變化,結(jié)果引起細(xì)胞膜對(duì)H+的通透性增加,使H+大量進(jìn)入細(xì)胞,降低了細(xì)胞內(nèi)外的離子濃度梯度,并使細(xì)胞質(zhì)的pH值下降,從而導(dǎo)致細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生變化,活性降低。2高濃度栽培對(duì)母氮代謝的影響2.1酵母細(xì)胞的代謝活力在啤酒釀造過程中,啤酒酵母的胞外蛋白酶活力很弱,麥汁中蛋白質(zhì)很難被降解利用,酵母繁殖所需要的氮源主要依靠吸收麥汁中的游離氨基酸(FAN)。在高濃麥汁中FAN濃度影響酵母的酒精耐受性和酒精生產(chǎn)速率,添加FAN可以提高最終的酒精濃度和細(xì)胞產(chǎn)量。Michael研究發(fā)現(xiàn),向高濃麥汁中添加甘氨酸也可以促進(jìn)酵母的生長和發(fā)酵,當(dāng)甘氨酸濃度逐漸增加到0.04mol/L時(shí),促進(jìn)效果最佳,添加賴氨酸可以縮短發(fā)酵周期,促進(jìn)酵母代謝活力,增加酵母細(xì)胞量。精氨酸、異亮氨酸和纈氨酸是合成酵母細(xì)胞的主要氨基酸,其中異亮氨酸和纈氨酸還是啤酒風(fēng)味物質(zhì)(雙乙酰、乙偶姻和2,3-戊二酮)的重要前體。Lies等檢測了在23°P高濃麥汁中酵母細(xì)胞的精氨酸和異亮氨酸、纈氨酸合成基因ARG1和LEU1的表達(dá)率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高濃條件下這2個(gè)基因的表達(dá)率降低了2-6倍。這說明高濃環(huán)境抑制了酵母細(xì)胞自身合成這些氨基酸的能力,使酵母只能從麥汁中獲得這些氨基酸,因此在高濃釀造過程中適當(dāng)?shù)奶岣啕溨羞@些氨基酸的含量有利于酵母細(xì)胞和風(fēng)味物質(zhì)的生成。2.2高濃釀造過程中疏水多肽含量的變化高濃釀造與低濃釀造的啤酒相比泡持性要差,在相同的主酵和后酵條件下,對(duì)18°P和12°P的全麥麥汁進(jìn)行發(fā)酵,最后均將乙醇稀釋成體積分?jǐn)?shù)為5%,測定啤酒泡持性(HRV)發(fā)現(xiàn)高濃釀造的HRV比低濃釀造低了10%。Cooper等研究發(fā)現(xiàn),在高濃釀造(20°P)過程中疏水多肽含量的降低比低濃釀造(10°P)顯著,而疏水多肽含量與HRV直接相關(guān),高濃釀造開始時(shí)發(fā)酵液中疏水多肽含量約為200mg/L,發(fā)酵結(jié)束時(shí)約為50mg/L,降低了75%,低濃釀造開始時(shí)疏水多肽含量約為140mg/L,到發(fā)酵時(shí)約為95%,僅降低了32%。在高濃釀造過程中,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,營養(yǎng)物質(zhì)缺乏,乙醇濃度和滲透壓升高會(huì)引起酵母細(xì)胞不正常的分泌胞外物質(zhì),蛋白酶A酶原就在此時(shí)大量的分泌到胞外,當(dāng)酶原遇到適宜的條件,如pH4.0-4.5的發(fā)酵液或啤酒時(shí)可以轉(zhuǎn)化成具有活性的蛋白酶A,蛋白酶A將疏水多肽降解,使啤酒泡沫穩(wěn)定性降低。在高濃釀造過程中,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,蛋白酶A活性逐漸升高,并且在整個(gè)發(fā)酵過程中,高濃釀造發(fā)酵液中蛋白酶A的活性均比低濃釀造高2倍以上。3高濃釀酒中的酯類物質(zhì)高濃釀造對(duì)啤酒風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要影響,Saerens等對(duì)比了高濃釀造(16°P)和低濃釀造(12°P)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)形成的影響(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),麥汁濃度升高對(duì)高級(jí)醇類和鄰?fù)愇镔|(zhì)影響并不顯著,對(duì)酯類物質(zhì)影響較為顯著,尤其是乙酸乙酯。高濃釀造啤酒的酯類含量相對(duì)較高,所以更容易產(chǎn)生異常的香氣和口味,因此控制高濃釀造啤酒中的酯類物質(zhì)含量是保證啤酒品質(zhì)重要的一環(huán)。Stewart等認(rèn)為高濃麥汁中可發(fā)酵性糖的組成是酯類物質(zhì)含量增高的主要原因,研究發(fā)現(xiàn)含質(zhì)量濃度為30%的麥芽糖漿(葡萄糖和果糖的含量較高)的20°P麥汁與含30%的高麥芽糖漿(麥芽糖和麥芽三糖的含量較高,葡萄糖和果糖的含量較低)的20°P麥汁相比,后者產(chǎn)生的乙酸乙酯和乙酸異戊酯含量約降低了25%。因此,提高高濃麥汁中麥芽糖的含量,將有利于控制酯類物質(zhì)的增加。酵母在含較高麥芽糖的麥汁中比在含較高葡萄糖和果糖的麥汁中生成較少的酯類物質(zhì)可能有2個(gè)原因,一是發(fā)酵麥芽糖生成乙酰CoA水平較低,二可能是麥芽糖的傳遞會(huì)影響酵母細(xì)胞內(nèi)pH,pH的變化將影響酯酶或酰基轉(zhuǎn)移酶的活性,從而影響酯的生成。4酵母細(xì)胞的生理狀態(tài)細(xì)胞通過水解三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)生成磷酸腺苷(AMP)釋放自由能,自由能的釋放與胞內(nèi)各種合成反應(yīng)和耗能過程緊密相關(guān)。在高濃釀造過程中,細(xì)胞膜對(duì)H+的通透性隨著乙醇濃度增加而增加,胞內(nèi)H+積累,使細(xì)胞質(zhì)pH發(fā)生變化,因此為了使細(xì)胞質(zhì)中pH值接近正常pH值(約為6.4),需要消耗大量的ATP將H+泵出細(xì)胞。ATP水解生成較高濃度的AMP或較高的ADP∶ATP能夠顯著的抑制酒精過量生成,維持酵母細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。Pedro等的研究也證實(shí)了這一點(diǎn),酵母在25°P麥汁中發(fā)酵,胞外的AMP濃度(3μmol/L)高于在15°P麥汁中發(fā)酵的AMP濃度(1μmol/L)。對(duì)于細(xì)胞的代謝反應(yīng),ATP、ADP和AMP濃度的比值關(guān)系,即能荷(EC)比ATP的絕對(duì)濃度更重要,EC值的變化保持在0-1。EC=[ATP]+0.5[ADP][ATP]+[ADP]+[AMP]EC=[AΤΡ]+0.5[ADΡ][AΤΡ]+[ADΡ]+[AΜΡ]Hysert等認(rèn)為EC值的變化可以用來指導(dǎo)啤酒的釀造。目前,對(duì)這種指導(dǎo)作用的機(jī)理的研究還存在著不同的觀點(diǎn)。Dombek等研究發(fā)現(xiàn),在高濃釀造過程中,乙醇比生產(chǎn)速率變化與EC值的變化是一致的,當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后,乙醇比生成速率降低,EC值也隨之降低,從0.7降到0.1,但是Pedro等對(duì)25°P麥汁進(jìn)行發(fā)酵,認(rèn)為EC值的變化與α-葡萄糖苷的吸收利用存在一定關(guān)系,在發(fā)酵液中酵母細(xì)胞對(duì)α-葡萄糖苷的吸收速率迅速降低時(shí),EC值和細(xì)胞活性也迅速下降。5保證優(yōu)良高濃釀造工藝的根本理論依據(jù)目前,有關(guān)啤酒高濃釀造的研究報(bào)道非常多,但絕大部分都是研究高濃釀造對(duì)酵母發(fā)酵性狀(耗糖、生物量和乙醇產(chǎn)量等)和酵母本身(大小、活性等)的影響,對(duì)酵母胞內(nèi)代謝情況影響的研究卻較少,而這些正是保證選育優(yōu)良高濃釀造酵母菌和優(yōu)化高濃釀造工藝的根本理論依據(jù)。雖然現(xiàn)在國外就高濃釀造對(duì)酵母代謝的影響做了一些工