云南天麻的遺傳多樣性及其多糖的比較

云南天麻的遺傳多樣性及其多糖的比較

天麻是天麻科的一種多年生草本植物。在我國(guó)主產(chǎn)于云、貴、川、藏4省區(qū),此外,陜西、河南、安徽、江西、湖北及東北各省也有分布。藥用其干燥塊莖,味甘、性微溫、祛風(fēng)、鎮(zhèn)痙。主要用于治療高血壓、眩暈、頭痛、口眼歪斜、肢體麻木、小兒驚厥、癲癇抽搐、破傷風(fēng),是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥之一?，F(xiàn)代藥理研究表明,天麻還具有增智健腦、清除自由基、延緩衰老的作用,對(duì)老年性癡呆有一定的療效。昭通天麻的產(chǎn)地主要分布于五蓮峰山脈和烏蒙山脈的交匯地帶,該地由于受特殊的“昆明準(zhǔn)靜止峰”氣候類(lèi)型的影響,常年云霧籠罩,冬季溫暖,夏季涼爽,空氣濕度較大,年平均氣溫15℃左右,闊葉林生長(zhǎng)茂盛,以腐殖土為主,土壤中含有豐富的天麻賴以生存的萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌,是天麻最適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。藥用天麻的4個(gè)變異類(lèi)型:烏天麻(G.elstaf.glauca.)、黃天麻(G.elstaf.flavida.)、紅天麻(G.elstaf.elata.)和綠天麻(G.elstaf.viridis.)在昭通均有分布。特別是昭通彝良縣小草壩是天麻的原產(chǎn)地,所產(chǎn)天麻個(gè)大、肥厚、飽滿、半透明、質(zhì)實(shí)無(wú)空心,品質(zhì)優(yōu)良,是昭通天麻的代表,也是云南天麻的代表,素有“云天麻”之稱。目前,昭通天麻已成為云南省第3個(gè)原產(chǎn)地域保護(hù)產(chǎn)品。天麻的有效成分有天麻素、天麻苷元、香草醛、香草醇、嘌呤類(lèi)、天麻多糖、氨基酸和微量元素等。最早的研究主要集中于天麻素和天麻苷元方面。目前,其他成分的研究越來(lái)越引起人們的重視,天麻多糖就是其中之一。天麻多糖有抗眩暈、抗衰老、降血壓、增強(qiáng)免疫、抑菌和抗病毒等多種藥理作用。本文以苯酚-硫酸法對(duì)產(chǎn)自昭通不同地區(qū)的14個(gè)人工栽培天麻樣品和3個(gè)外省天麻樣品進(jìn)行多糖測(cè)定和比較。1材料和方法1.1腐敗變質(zhì)預(yù)處理2010年1月中旬,在昭通各產(chǎn)地分別采集鮮“冬麻”2kg左右,洗凈泥沙,剔除腐敗變質(zhì)部分,切成薄片,在70℃烘箱中通風(fēng)烘1d左右至干,粉碎,過(guò)100目篩,得干粉,保存?zhèn)溆?。其他省份?個(gè)天麻樣品均購(gòu)自昆明市菊花村中藥市場(chǎng),同樣粉碎過(guò)篩備用。天麻品種及產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。1.2天麻糖的提取取適量天麻干粉,按料液比1∶60加入80%乙醇,在60℃水浴中回流提取2h,倒去液體,殘?jiān)僦貜?fù)提取1次,除去天麻中的單糖、低聚糖、色素及脂類(lèi)等。殘?jiān)脽o(wú)水乙醇脫水,置陰涼處晾數(shù)日至干,粉碎,置棕色廣口磨口瓶中備用。1.3無(wú)水乙醇用量大,測(cè)定超聲波清洗器.儀器試劑:葡萄糖、苯酚購(gòu)自天津市化學(xué)試劑三廠,硫酸購(gòu)自汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品有限公司,碳酸氫鈉購(gòu)自天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司,無(wú)水乙醇購(gòu)自天津紅巖化學(xué)試劑廠,均為分析純;鋁片。儀器:7200可見(jiàn)分光光度計(jì),0412-1型離心機(jī),KH-400KDB型高功率數(shù)顯控超聲波清洗器。苯酚試劑:稱取約5g重蒸酚(苯酚50g,鋁片0.05g和碳酸氫鈉0.025g,常壓蒸餾,收集182℃餾分),用新鮮蒸餾水溶解于100mL容量瓶中定容,配制成5%溶液置棕色瓶中,放入冰箱儲(chǔ)存待用。1.4溶液配制和配制對(duì)照品溶液:精確稱取葡萄糖(105℃恒質(zhì)量)0.1000g,用蒸餾水溶解于100mL容量瓶中定容,配制成1.000mg/mL溶液待用。供試品溶液:精確稱取1g用80%乙醇提取并干燥過(guò)的天麻粉預(yù)處理樣品,以超聲波提取法的最佳提取條件(以蒸餾水為溶劑,溫度65℃、料液比1∶20、提取時(shí)間20min)提取,提取液用4000r/min離心機(jī)離心10min,棄除沉淀,上清液用100mL容量瓶定容待用。2結(jié)果與分析2.1苯酚溶液的制備精確量取1.0mL對(duì)照品溶液于比色管中,加蒸餾水補(bǔ)至4.0mL,空白用4.0mL蒸餾水,依次加入1.0mL苯酚溶液,5.0mL濃硫酸,搖勻于沸水中加熱10min,取出后稀釋至25.0mL,冷卻至室溫。用分光光度計(jì)作全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果在490nm處吸光度有最大吸收,故選用490nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精確量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8mL對(duì)照品溶液于不同比色管中,在490nm測(cè)吸光度,結(jié)果見(jiàn)表2,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1,回歸方程:y=8.4829x-0.0109,r=0.9973。2.3精密度測(cè)試精確吸取2.0mL對(duì)照品溶液5份,置于不同比色管中,在490nm測(cè)吸光度,結(jié)果見(jiàn)表3。2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精確吸取1.2mL供試品溶液,置不同比色管中,放置1.0h后每隔0.5h在490nm測(cè)吸光度,結(jié)果見(jiàn)表4。2.5天麻還原糖含量測(cè)定稱取初處理的天麻樣品1.0006g,配制供試品溶液,在490nm測(cè)吸光度,計(jì)算樣品天麻還原糖含量為0.1432g。再分別取0.5mL供試品溶液6份,置于不同比色管中,在490nm測(cè)吸光度。再分別加入葡萄糖0.1432g,在490nm測(cè)定吸光度,結(jié)果見(jiàn)表5。2.6天麻多糖含量的計(jì)算把初處理后的17個(gè)天麻樣品,各精確稱取2份,每份1g,在490nm測(cè)吸光度,用回歸方程計(jì)算多糖濃度,進(jìn)而計(jì)算天麻樣品多糖含量,結(jié)果見(jiàn)表6。在測(cè)定的17個(gè)天麻樣品中,昭通彝良縣小草壩鄉(xiāng)一帶所產(chǎn)的9個(gè)天麻樣品的多糖含量為10.4%~21.6%,普遍較其他地區(qū)高,據(jù)此可8為原產(chǎn)地域產(chǎn)品昭通天麻的優(yōu)良品質(zhì)提供依據(jù),也可為彝良縣小草壩鄉(xiāng)作為最適宜栽培天麻的地區(qū)提供理論支持。3精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)多糖測(cè)定有多種方法,通過(guò)試驗(yàn),苯酚-硫酸法用于天麻多糖測(cè)定較為適合。在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,回歸方程:y=8.4829x-0.0109,r=0.9973。精密度試驗(yàn),RSD=0.07%;穩(wěn)定性試驗(yàn),RSD=1.67%;加樣回收率100.6%,RSD=1.37%。測(cè)定方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確。天麻多糖是僅次于天麻素的天麻重要有