肉蓉多糖提取工藝優(yōu)化及其抑菌作用測(cè)定

肉蓉多糖提取工藝優(yōu)化及其抑菌作用測(cè)定

肉豆是列出的肉豆科多年生草本植物。世界上約有20種，中國(guó)約6種，主要分布在內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、寧夏等地。由于肉蓯蓉生長(zhǎng)環(huán)境嚴(yán)酷,氣候極端干旱,多生長(zhǎng)在荒漠中,具有極好的藥用價(jià)值,素有“沙漠人參”之美譽(yù)。文獻(xiàn)報(bào)道肉蓯蓉含有多糖、苯乙醇苷、生物堿、有機(jī)酸等多種成分。而多糖類成分在增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤方面的作用愈來(lái)愈受到人們的重視,其中對(duì)免疫增強(qiáng)作用的機(jī)理研究已深入到分子、受體水平。但對(duì)肉蓯蓉多糖的抑菌作用研究還未見報(bào)道。筆者主要對(duì)肉蓯蓉多糖的提取工藝及抑菌性能進(jìn)行研究,旨在使這種名貴、稀有的中藥材在更多的領(lǐng)域得到更好的、更合理的開發(fā)和利用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1測(cè)試材料肉蓯蓉植株采于甘肅白銀平川區(qū)野外。1.1.2試驗(yàn)藥物葡萄糖、95%乙醇、濃硫酸、苯酚、正丁醇、三氯甲烷等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.3疊菌種一種最適菌種枯草桿菌(Bacillussubtilis),大腸桿菌(Escherichiacoli),四疊球菌(Micrococcusterragenus),啤酒酵母(Scerevisiaehensen),米曲霉(A.oryzae),橘青霉(Penicilliumsp.),黑曲霉(Aspergillusnigers)。以上菌種均由河西學(xué)院生命科學(xué)與工程系微生物實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.4日本alp.1.2電子分析天平;超凈工作臺(tái);復(fù)日菌落計(jì)數(shù)器;青島-利勃海爾電冰箱;日本ALP全自動(dòng)高壓滅菌鍋;DPX-9272B-1電熱恒溫培養(yǎng)箱;MJX智能霉菌培養(yǎng)箱;F-GZX101-3S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。1.1.5ggPDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200g,瓊脂20g,蔗糖20g,水1000ml,pH自然,121℃滅菌20min。NA培養(yǎng)基:牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,瓊脂15～20g,水1000ml,121℃滅菌20min。1.1.6菌株42將相對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)菌種接種在斜面培養(yǎng)基上,細(xì)菌37℃活化18h,真菌32℃活化24～48h。以無(wú)菌生理鹽水配制成菌懸液(107～108CFU/ml)備用。1.2方法1.2.1肉桂枝提取糖1.2.1.蛋白沉淀法干燥肉蓯蓉粉末→95%乙醇浸泡2h→烘干→熱水浸提→過(guò)濾除渣→醇沉24h→離心去上清液→沉淀物溶解定容至50ml→Ssevage法除蛋白→再次定容至50ml→測(cè)吸光度。1.2.1.提取多糖的制備準(zhǔn)確稱取肉蓯蓉粉末3g,加95%乙醇浸泡2h后,過(guò)濾,取濾渣,于80℃烘箱內(nèi)烘干。以提取溫度、水料比和提取時(shí)間為試驗(yàn)因素,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上按表1進(jìn)行正交試驗(yàn),提取多糖。每組提取次數(shù)均為2次,然后合并濾液,濃縮濾液至原體積的1/5,濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇,充分?jǐn)嚢韬笾帽溥^(guò)夜沉淀。棄上清,3000r/min離心10min,收集沉淀。沉淀用適量蒸餾水溶解并定容至100ml,置于分液漏斗,按照1∶1量加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1),振蕩30min,靜置,分離數(shù)次。直到?jīng)]有乳白色變性蛋白質(zhì)析出為止,收集上清液,定容至50ml待用。1.2.1.多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法。取樣品1ml,加入1ml蒸餾水再加入1ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液和5ml濃硫酸搖勻后于25℃靜置20min,于波長(zhǎng)490nm處測(cè)其吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即得多糖含量。1.2.2肉桂枝提取物的抗菌性檢測(cè)1.2.2.菌懸液的制備及抑菌性測(cè)定將多糖提取物配制成濃度為1.748mg/ml的溶液,采用圓紙片法測(cè)定其抑菌活性。分別刮取活化后的供試菌(7種)菌苔于50ml生理鹽水中,振蕩搖勻得菌懸液,分別用移液槍注入0.2ml于培養(yǎng)基平板上,涂勻,取已消過(guò)毒的圓形濾紙(￠6mm)用糖液浸泡過(guò)夜。撈出略干后貼于培養(yǎng)基平板上。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(細(xì)菌36～37℃,18～24h;真菌28～30℃,48～72h)后分別觀察其抑菌性。以上步驟均按無(wú)菌條件操作,每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)平行,結(jié)果取平均值。1.2.2.抑菌圈最短時(shí)mic的濃度采用圓紙片法,方法同上,將多糖溶液稀釋成1.748、0.874、0.437、0.2185、0.10925mg/ml的濃度梯度,以未見抑菌圈的最高濃度為MIC。2結(jié)果與分析2.1浸提溫度和時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響肉蓯蓉多糖熱水浸提法浸提次數(shù)均為2次,影響熱水浸提法的因素主要有浸提溫度、浸提時(shí)間和水料比。試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用3因素3水平正交法確定最佳浸提條件。由表2的極差分析結(jié)果可見,影響肉蓯蓉?zé)崴岱ǖ囊蛩刂鞔雾樞蚴茿、C、B。由試驗(yàn)結(jié)果分析可知,3個(gè)因素的最佳組合是A2B2C2,即浸提溫度85℃,浸提時(shí)間2h,加水量為1∶15。試驗(yàn)結(jié)果表明,浸提溫度對(duì)多糖獲得量的影響最大。85℃浸提多糖獲得量最多,隨著溫度的升高得量反而下降。浸提溫度過(guò)高,可能破環(huán)了多糖的結(jié)構(gòu),使多糖含量降低;浸提溫度太低時(shí),不利于多糖的徹底溶出。溶劑的用量增大,有利于多糖溶出,水料比為15∶1時(shí),所得多糖最多,表明這時(shí)多糖溶解較充分。水料比太小,多糖不能完全溶解,造成提取不完全;水料比太大,在濃縮、回收時(shí)比較困難,造成浪費(fèi)。當(dāng)浸提時(shí)間為2h時(shí)所得多糖的量最多,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),多糖量反而減少。這可能是由于浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng),多糖在水中的溶出趨于平衡,多糖量提高很少。2.2抑菌圈直徑的測(cè)定圖1是肉蓯蓉多糖溶液對(duì)四疊球菌、枯草桿菌、大腸桿菌和啤酒酵母的抑菌作用結(jié)果。由圖1可見,肉蓯蓉多糖溶液對(duì)供試菌種具有抑菌活性。肉蓯蓉多糖提取物對(duì)大腸桿菌、四疊球菌、枯草桿菌、啤酒酵母、橘青霉的抑菌圈直徑分別為8.96、11.20、10.24、8.16、7.84mm。由此可見,肉蓯蓉多糖溶液對(duì)3種供試細(xì)菌都有抑制作用,其中對(duì)四疊球菌的抑制作用最強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)11.20mm,其次為枯草芽孢桿菌,抑菌圈直徑達(dá)10.24mm。供試的4種真菌中肉蓯蓉多糖提取物對(duì)啤酒酵母、橘青霉有抑制作用,其中對(duì)啤酒酵母的抑制作用較強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)8.16mm,對(duì)黑曲霉和米曲霉的抑菌作用不明顯。肉蓯蓉多糖提取物抗菌活性結(jié)果表明,肉蓯蓉多糖提取物對(duì)一些細(xì)菌與真菌都顯示了不同程度的抑制作用,說(shuō)明肉蓯蓉多糖在抗動(dòng)植物病原菌方面有潛在應(yīng)用價(jià)值。2.3別分布為0.1337、0.1337、0.1334肉蓯蓉多糖提取物對(duì)大腸桿菌、四疊球菌、枯草桿菌、啤酒酵母、橘青霉的MIC分別為0.437、0.109、0.218、0.437、0.874。由此可見,肉蓯蓉多糖提取物對(duì)四疊球菌的最小抑菌濃度在所試菌種中濃度最小,表明四疊球菌是測(cè)定肉蓯蓉多糖MIC的較好指示菌,肉蓯蓉多糖提取物對(duì)橘青霉的MIC最高。3肉麗多糖的抑菌性研究通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)肉蓯蓉多糖的提取工藝進(jìn)行研究,確定肉蓯蓉多糖提取結(jié)果的諸因素及其主次順序?yàn)樘崛囟?gt;水料比>提取時(shí)間,肉蓯蓉多糖的最佳提取工藝為:以蒸餾水為提取劑、提取溫度85℃、提取時(shí)間2h、水料比15∶1。在此條件下,肉蓯蓉多糖含量可達(dá)6.7857mg/g。用濾紙片法對(duì)肉蓯蓉多糖提取物進(jìn)行抑菌性研究,結(jié)果表明肉蓯蓉多糖具有一定的抑制細(xì)菌及真菌生長(zhǎng)的作用。對(duì)細(xì)菌的抑