原生質體融合技術在優(yōu)良釀酒酵母研究中的應用

原生質體融合技術在優(yōu)良釀酒酵母研究中的應用

母乳喂養(yǎng)是酒精工業(yè)的靈魂。良好的酵母不僅可以保證產(chǎn)品的質量,還可以提高生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本。因此,選育優(yōu)良的酵母菌株,改善酵母菌的生產(chǎn)性能,對釀酒工業(yè)尤為重要。但是,由于工業(yè)用酵母菌株優(yōu)良特性的遺傳控制背景十分復雜,同時由于長期人為培養(yǎng)使用等原因,很多菌株已喪失了產(chǎn)生孢子能力或成為孢子不育株,這使得傳統(tǒng)雜交育種和現(xiàn)代的基因工程育種手段都受到一定程度的限制。而原生質體融合技術可克服細胞壁的天然屏障,排除接合型的限制,實現(xiàn)多基因重組,還可直接采用生產(chǎn)性狀好的菌株作為親株,加速工業(yè)酵母菌種改良進程,為優(yōu)良工業(yè)酵母的選育提供了一個嶄新的途徑。1助融作用的融合原生質體融合(protoplastfusion)也稱細胞融合(cellfusion),是將雙親株細胞通過酶解破壁(動物細胞除外),使之成為球狀的原生質體,然后等量混合于高滲緩沖液中,在物理的(如電融合)或化學的(如聚乙二醇)或生物的(如仙臺病毒)助融作用下,使雙親的原生質體發(fā)生相互凝集,通過細胞質融合(plasmogamy)、核融合(karyogamy),進行基因組建的交換、重組,然后在適宜的條件下再生出細胞壁,獲得融合子(fusant)的過程。應用原生質體融合技術進行酵母菌育種一般包括以下幾個步驟:融合親株的篩選、融合子篩選方法的確定、原生質體的制備、原生質體的融合、融合子的篩選與鑒定、融合株生產(chǎn)性能的測試等。2原生質體融合的探索1912年Lamnbent在觀察多核細胞形成的過程時發(fā)現(xiàn)了細胞融合現(xiàn)象。此后,Muller和Barski也相繼觀察到了細胞融合現(xiàn)象。1958年Okada發(fā)現(xiàn)并證明了紫外滅活仙臺病毒可誘發(fā)體內(nèi)艾氏腹水癌細胞彼此融合,開拓了細胞融合研究的先河。1953年,Weibull等首次用溶菌酶制備得到了巨大芽孢桿菌的原生質體,并提出了原生體的概念。之后Eddy,Emmerson,Cocking又以酶法相繼制備出了酵母菌、絲狀真菌和番茄幼根細胞的原生質體,為微生物和植物的細胞融合開辟了道路。1974年,加拿大籍華人高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)在Ca2+參與下能促進植物細胞原生質體融合,這一發(fā)現(xiàn)極大地促進了細胞融合技術的發(fā)展。以后又發(fā)展了電場誘導融合法、激光誘導融合法。1978年,第三屆工業(yè)微生物遺傳學討論會上,把原生質體融合作為一種新的基因重組手段提出來,引起了全世界的關注。此后,越來越多的研究者認識到它的重要應用價值,不斷提出并完善了一系列技術方法,并將其運用到微生物的遺傳、生理、代謝、形態(tài)方面的研究和工業(yè)菌株選育工作中,極大地推動了微生物研究的進程。3釀酒酵母的應用自1977年Sipiczki等首次實現(xiàn)了酵母原生質體融合以來,國內(nèi)外研究者開展了廣泛的研究,已成功地實現(xiàn)了酵母的種、屬間的融合,構建了一些有重要應用價值的釀酒酵母。有的研究者還進行了酵母與霉菌、酵母與細菌的融合,極大地豐富了酵母的遺傳多樣性,促進了酵母菌的形態(tài)、生理和遺傳研究,加速了優(yōu)良工業(yè)酵母菌株的選育。3.1糖化酵母融合子的檢測釀酒酵母缺乏編碼淀粉水解酶的基因,不能直接利用淀粉生產(chǎn)酒精。而糖化酵母、黑曲霉、內(nèi)孢霉等則可分泌淀粉酶,水解淀粉。糖化性狀的表達受多基因控制,且受到雜合型a/α的限制。應用原生質體融合技術,將其它菌株中的糖化基因轉入釀酒酵母中,則將大大縮短工藝流程,降低生產(chǎn)成本。國內(nèi)研究者將釀酒酵母和糖化酵母等具有淀粉酶活性的菌株進行種、屬間融合,構建出一些具有淀粉糖化酶活性的酵母菌株[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。左小明等研究發(fā)現(xiàn),STA1、STA2、STA3的劑量效應并不總是隨著核倍性遞增,而只有當各自純合時才表現(xiàn)出表達的劑量效應;Masaokishida等在研究S.fibuligera和糖化酵母融合時發(fā)現(xiàn),融合子染色體電泳遷移方式只有細微的差別,α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶編碼基因的DNA雜交結果表明,這兩種基因在融合重組時或是被復制或是被消除,導致融合子形成了嵌和型染色體。李桃生等認為釀酒酵母和糖化酵母親緣關系較近,容易形成穩(wěn)定的融合子。研究發(fā)現(xiàn),釀酒酵母與Aureobasidiumpullulans、Endomycesfibuligena、S.fibuligera、Endomycopsisfibnligera、Candidatropicalis等進行的屬間融合不易獲得穩(wěn)定的融合子。黎碧蓮等為提高屬間融合子的穩(wěn)定性,避免糖化酶分泌性狀發(fā)生分離,采用間接選擇法,以糊精發(fā)酵為選擇壓力,促使融合子向發(fā)酵淀粉原料方向穩(wěn)定。在啤酒酵母應用方面,陳海昌等將啤酒酵母(S.carlsbergenisis)和糖化酵母進行融合,獲得了具有糖化能力的啤酒酵母。3.2酵母菌種的培養(yǎng)酒精發(fā)酵過程中,由于環(huán)境高溫和發(fā)酵過程放熱等原因,造成發(fā)酵醪溫度過高,普通酵母難以進行正常的生長和發(fā)酵,衰老過程加快,出酒率低,必須外加制冷設備維持正常的生產(chǎn)。應用原生質體融合技術,將某些耐高溫菌株與工業(yè)菌株融合,構建耐高溫產(chǎn)酒率高的酵母菌株,具有重大的現(xiàn)實意義。日本的品川早苗最早將高產(chǎn)酒精酵母和耐高溫酵母進行種內(nèi)融合,得到了可以在40℃產(chǎn)酒精的酵母;隨后,國內(nèi)外研究者開展了一系列研究,實現(xiàn)了種屬間融合,構建了一些耐高溫菌株[13,14,15,16,17,18,19]。文鐵橋等將釀酒酵母與呼吸缺陷型耐高溫克魯維酵母融合,在TTC培養(yǎng)基上篩選,得到的融合子在45℃產(chǎn)酒率可達7.4%。孫君社等采用呼吸缺陷型遺傳標記結合高溫(45℃)條件培養(yǎng)對融合產(chǎn)物進行篩選,得到了穩(wěn)定的融合子。楊汝德等利用加熱(80℃,30min)和紫外線照射(功率30w,距離30cm,2min)滅活雙親后進行融合,獲得了成功,徹底避免了遺傳標記對親株生產(chǎn)性狀造成的不利影響,為原生質體融合技術在工業(yè)酵母菌株育種上的廣泛應用開辟了新的途徑。3.3高效利用嗜殺酵母酒類釀造過程中,常常易出現(xiàn)酵母雜菌污染的情況,輕者影響了產(chǎn)品的質量,重者造成巨大的浪費,嚴重影響企業(yè)的經(jīng)濟效益。嗜殺酵母細胞內(nèi)具有嗜殺質粒,控制菌體分泌毒素,可殺死敏感菌株。將嗜殺酵母中的嗜殺質粒轉移到具優(yōu)良發(fā)酵特性的菌株中,對防治酵母污染,凈化發(fā)酵體系,具有重要意義。BortolA等將經(jīng)紫外線滅活的嗜殺酵母與糖化酵母融合,再利用嗜殺酵母對融合產(chǎn)物進行篩選,得到了糖化型嗜殺酵母。以后,杜連祥等,SuloP等,王昌祿等也進行了探索,獲得了具有嗜殺活性的啤酒酵母。杜金華等選擇具有核缺陷的嗜殺菌株(kar1-1,his4)作為供體成功地將嗜殺質粒轉移到了蘋果酵母中,避免了嗜殺質粒轉移時引起不必要的核基因改變,為細胞質基因的有效轉移提供了可靠途徑。3.4酵母原生質體融合子選育酵母細胞的絮凝性是衡量優(yōu)良酵母生產(chǎn)菌株的一個重要指標。良好的絮凝性不僅能加快發(fā)酵液的澄清速度,降低酵母分離能耗,而且還可以防止因酵母自溶所導致的風味敗壞。將絮凝性酵母與非絮凝性酵母進行融合重組,提高優(yōu)良酵母的絮凝性,對啤酒生產(chǎn)具有重大意義。deFigueroa等,江慧修等,陳海昌等,JavadekarVS等,周東坡等及Watari等將非絮凝性酵母與絮凝性強的酵母進行原生質體融合,獲得了絮凝性好、發(fā)酵力強的融合子。其中,江慧修等利用紅霉素抗性突變和小菌落呼吸缺陷突變作為篩選標記,將發(fā)酵力強的酵母與絮凝性好的酵母進行電誘導融合,所得融合子經(jīng)凝集性、發(fā)酵力、細胞表面疏水性能、細胞DNA含量、穩(wěn)定性測定和小型發(fā)酵試驗證明,具有雙親的優(yōu)良性狀。同時也證明,誘導線粒體基因突變標記對工業(yè)菌株進行原生質體融合育種是一種有效途徑。JavadekarVS等利用benomyl(一種真菌毒素)抗性作為篩選標記,將嗜殺酵母和高絮凝性酵母融合,得到了絮凝性好的嗜殺酵母,但在甘蔗糖蜜中發(fā)酵試驗,絮凝性狀消失,其原因尚不清楚。3.5酵母菌種的選擇在降解蘋果酸強的葡萄酒酵母和增香酵母選育上也有研究者進行了探索。高年發(fā)等將釀酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)進行屬間融合,選育出降解蘋果酸能力強的葡萄酒酵母。王瑞明等,趙華等將異常漢遜酵母異常變種(Hansenulaanomala)產(chǎn)乙酸乙酯能力部分地轉到釀酒酵母中,得到了產(chǎn)香能力強的酵母菌株;日本學者Munekazukishimoto將嗜冷酵母與中溫酵母融合,構建出低溫果酒增香酵母,發(fā)酵試驗證明,蘋果酸、乙醇、苯乙醇、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯的產(chǎn)率較中溫釀酒酵母有所提高。因為控制酵母發(fā)酵產(chǎn)香性狀的基因眾多,很難利用轉基因、定點突變等技術進行構建,所以通過原生質體融合技術構建增香酵母最有可能解決某些果酒上長期存在的香氣不足的問題。4原生質和生物化合技術的應用前景和現(xiàn)有問題4.1原生質體融合技術釀酒工業(yè)一般要求所使用的酵母具有耐高溫/低溫、耐酒精、高產(chǎn)酒精、糖化能力強、嗜殺、產(chǎn)香、絮凝性好等優(yōu)良的生產(chǎn)性狀。生產(chǎn)不同產(chǎn)品所需的酵母性狀有所不同,但每一種產(chǎn)品的生產(chǎn)都需要具有多種優(yōu)良性狀的菌種,而真正具有多種優(yōu)良性狀的菌株又寥寥無幾。應用原生質體融合技術,實現(xiàn)多種優(yōu)良性狀的整合,構建出理想的酵母菌株,將對釀酒工業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。而且,通過原生質體融合技術進行優(yōu)良酵母菌選育的同時,還可以通過對融合子的遺傳分析,研究產(chǎn)量性狀的表達機制,各種性狀之間的影響以及各種代謝途徑中關鍵控制酶的作用,從而更加深入的研究酵母的發(fā)酵性能,提高生產(chǎn)