ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤藥物研究中的應(yīng)用

ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤藥物研究中的應(yīng)用

近年來，腫瘤藥物的研究已從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)腫瘤的生長(zhǎng)，發(fā)展了相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的快速分化，并促進(jìn)了正常調(diào)整機(jī)制的發(fā)展。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞對(duì)外界刺激作出必要反應(yīng)的途徑,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān),選擇性的阻斷腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路,破壞其自控性生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制,已成為極具吸引力的抗腫瘤藥物研究熱點(diǎn)。本文僅就與Ras蛋白信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)的靶點(diǎn)及其在抗腫瘤藥物研究中的作用予以介紹。1ras蛋白結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),大約30%的人類腫瘤均存在Ras基因的突變激活及Ras蛋白表達(dá)水平增高的現(xiàn)象,因此調(diào)控Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在以細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)中起著重要作用。Ras基因家族有三個(gè)成員:Ha-Ras、Ki-Ras和N-Ras。成員的生化和結(jié)構(gòu)特性非常接近,前166個(gè)氨基酸是維持Ras的功能所必需的,羧基末端的四個(gè)氨基酸均由CAAX構(gòu)成(C為半胱氨酸,A為脂肪族氨基酸,X為任意氨基酸)。Ras蛋白可以認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的信號(hào)通路的重要元件,是控制外來分子信號(hào)的分子開關(guān)。Ras蛋白的晶體結(jié)構(gòu)表明它以GDP結(jié)合和GTP結(jié)合兩種形式存在,當(dāng)Ras蛋白與GTP結(jié)合(Ras-GTP),形成活化狀態(tài)(開),與GDP結(jié)合(Ras-GDP),為失活狀態(tài)(關(guān)),這種“開關(guān)”分別由GTP酶活化蛋白(GTPaseactivatingprotein,GAP)和鳥苷酸交換因子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF)兩種調(diào)節(jié)蛋白決定。GEF作用于Ras-GDP將Ras蛋白游離出來,Ras再與GTP結(jié)合從而將其激活;存在于正常細(xì)胞中的GAP,主要作用是激活Ras蛋白的GTP酶,從而將結(jié)合在Ras蛋白上的GTP水解成GDP,成為失活型的蛋白,見圖1。若Ras蛋白持續(xù)處于活化狀態(tài),可與下游的效應(yīng)蛋白結(jié)合,將信號(hào)傳遞到下游信號(hào)元件,可能引起細(xì)胞的異常增殖,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Ras蛋白能被復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)激活,其下游的級(jí)聯(lián)途徑同樣復(fù)雜,對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用。所以了解Ras蛋白的信號(hào)通路有助于尋找新的抗癌藥物作用靶點(diǎn)。2ras蛋白質(zhì)信號(hào)調(diào)導(dǎo)路徑2.1影響ras活性的因素Ras蛋白是RTK信號(hào)的一個(gè)主要匯聚點(diǎn),由于Ras的活化受GEF和GAP調(diào)控,因此任何影響RasGEF、Ras-GAP或它們之間平衡的因素均可調(diào)控Ras活性。2.1.1sh2區(qū)域及其兩側(cè)sh3區(qū)域組成生長(zhǎng)因子受體-聯(lián)結(jié)蛋白2(Grb-2)在蛋白酪氨酸激酶信號(hào)途徑中起重要作用,此蛋白由單一的SH2區(qū)域及其兩側(cè)的SH3區(qū)域組成。SH2區(qū)域可與一系列磷酸化的酪氨酸激酶受體結(jié)合,并且通過SH3區(qū)域與其下游靶標(biāo)鳥苷酸交換因子SOS結(jié)合并定位于細(xì)胞膜,法尼基化的Ras蛋白也定位于細(xì)胞膜上,SOS接近Ras,使Ras蛋白轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)而引起細(xì)胞的增生與分化。2.1.2酪氨酸激酶受體結(jié)合絕大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)因子,如DGF、FGF、HGF、IGF、PDGF、VEGF等,通過與細(xì)胞膜上相應(yīng)的酪氨酸激酶受體結(jié)合,促使受體形成二聚體并激活膜內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶,使得受體自身發(fā)生酪氨酸磷酸化,然后與Grb2的SH2區(qū)域結(jié)合,引發(fā)一系列活化Ras蛋白途徑。如表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶EGFR,具有一個(gè)細(xì)胞外配體結(jié)合域、一個(gè)跨膜域及一個(gè)與酪氨酸激酶結(jié)合的胞內(nèi)域,在多數(shù)實(shí)體瘤中都有表達(dá)或高表達(dá)。2.1.3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系這組受體家族,能誘導(dǎo)類似受體酪氨酸激酶反應(yīng),但又沒有內(nèi)源性催化活性。募集非受體酪氨酸激酶和接下來的酪氨酸磷酸化通常是形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的第一步。在腫瘤中非受體酪氨酸激酶常被激活,主要是通過突變,基因重排形成融合蛋白等方式使其處于持續(xù)激活狀態(tài),從而激活下游信號(hào)途徑如Ras/MAPK、PI3K/Akt途徑,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抵抗細(xì)胞調(diào)亡。2.1.4非受體蛋白法接頭蛋白SHC(srchomologousandcollagen)可介導(dǎo)Grb-2與受體之間的相互作用;許多非受體蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化后也能作為Grb-2的錨定位點(diǎn);許多細(xì)胞因子、趨化因子和整合素受體等均可通過上述途徑激活Ras。2.2ras下游信號(hào)的標(biāo)記活化的Ras能結(jié)合和激活一系列的效應(yīng)酶,通過下游的效應(yīng)因子介導(dǎo)多種生物學(xué)功能,調(diào)控細(xì)胞增殖、生存等細(xì)胞應(yīng)答。2.2.1ras蛋白激活機(jī)制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Raf是目前研究最完善的Ras效應(yīng)因子。Ras蛋白上含直接結(jié)合并激活Raf的位點(diǎn),Ras-GTP活化形式與Raf結(jié)合后可使Raf重新定位于細(xì)胞膜,并引發(fā)有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)途徑的級(jí)聯(lián)放大作用,從而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。2.2.2ptdins基因型化活化的Ras能直接結(jié)合并激活PI3K的p110催化亞基,PI3K活化后將PtdIns(4,5)P2轉(zhuǎn)化生成第二信使PtdIns(3,4,5)P3,然后通過Rac/Cdc42等調(diào)控細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)及通過激活生存信號(hào)激酶AKT/PKB等靶蛋白調(diào)控細(xì)胞生存。2.2.3forkford蛋白家族它是Ras相關(guān)蛋白R(shí)al的GTP/GDP交換因子(GEF),其下游的靶標(biāo)包括轉(zhuǎn)錄因子Forkhead蛋白家族(可促進(jìn)凋亡基因轉(zhuǎn)錄)。RALGDS和AKT/PKB都能抑制Forkhead族蛋白的活性,阻斷促凋亡基因和CDK抑制物的轉(zhuǎn)錄,使細(xì)胞免于凋亡并加速細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞生長(zhǎng),引起癌細(xì)胞增殖。2.3凋亡的相關(guān)因素Ras、Raf與MAPK信號(hào)途徑形成交錯(cuò)的生物信息網(wǎng),協(xié)調(diào)蛋白或轉(zhuǎn)錄因子磷酸化,調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡,在腫瘤發(fā)生中起重要的作用?，F(xiàn)今了解比較清楚的有Raf-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、JNK-SAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這是三條并行的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,相互調(diào)控,介導(dǎo)著不同的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng),級(jí)聯(lián)途徑見圖2。這里主要就Raf-MEK-ERK和JNK-SAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑加以簡(jiǎn)述。2.3.1各類互通激酶檢測(cè)信號(hào)級(jí)聯(lián)的核心成分是3種激酶即蛋白激酶(MAPK,又稱ERK)、MAPK激酶(MAPKK或MEK)和MAPKK激酶(MAPKKK或MEKK)。其轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是:首先Ras在細(xì)胞外信號(hào)刺激下轉(zhuǎn)化為激活型Ras,位于細(xì)胞質(zhì)的Raf移向細(xì)胞膜并被活化,活化了的Raf再活化MAPKK,MAPKK經(jīng)磷酸化最終激活MAPK,一旦該通路發(fā)生過度激活,細(xì)胞增殖的加速與細(xì)胞生存期的延長(zhǎng)可導(dǎo)致腫瘤的形成和發(fā)展。2.3.2sek及mesk激活激活變異型Ras活化JNK(c-JunN-terminaladekinase)的傳遞通路同Ras至MAPK一樣,在JNK的上游也存在著激酶級(jí)聯(lián),研究表明SEK/MKK4/JNKK是磷酸化JNK的活化因子,而MEKK是激活SEK的激酶,Ras至JNK的傳遞路徑為Ras→MEKK→SEK→JNK。同樣,此通路過度激活可加速細(xì)胞增殖導(dǎo)致腫瘤。其他通路同樣通過信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑可引發(fā)蛋白激酶過度活化,細(xì)胞周期紊亂,細(xì)胞過度增殖等,最終發(fā)生腫瘤及其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。3相關(guān)抗腫瘤化合物的臨床研究針對(duì)Ras蛋白及其信號(hào)通路的控制,已經(jīng)成為抗腫瘤的有效途徑。目前大量的相關(guān)抗腫瘤化合物已被發(fā)現(xiàn)、設(shè)計(jì)并合成,部分已經(jīng)進(jìn)入臨床研究,并取得了良好療效。隨著研究的不斷深入,活性好、選擇性高的化合物不斷被發(fā)現(xiàn),已成為現(xiàn)今抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。3.1ras蛋白上游路徑的抑制劑3.1.1磷酸基化反應(yīng)許多高活性的磷酸酪氨酸Grb2-SH2抑制劑已經(jīng)被設(shè)計(jì)和合成出來,如化合物1(IC50=7.6μmol·L–1)和2(IC50=0.53μmol·L–1),但磷酸基團(tuán)的高電荷性和易水解性導(dǎo)致其難以進(jìn)入細(xì)胞,活性較低。于是人們將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向非磷酸抑制劑,已有相關(guān)的非磷酸基團(tuán)的擬肽類化合物報(bào)道,如化合物3(IC50=65μmol·L–1)和4(IC50=0.6μmol·L–1),其萘環(huán)及草?；赡苁瞧淞己没钚缘年P(guān)鍵。3.1.2氨基喹唑啉衍生物已知EGFR是酪氨酸激酶主要成員,其抑制劑主要分為兩大類:特異性單克隆抗體和小分子化合物。單克隆抗體與配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGFR,抑制配體激活EGFR的PTK,并促進(jìn)EGFR內(nèi)吞,從而產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng);小分子化合物能與EGFR胞內(nèi)區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合,抑制蛋白酪氨酸激酶磷酸化,阻斷瀑布式的信號(hào)傳遞。通過對(duì)激酶ATP結(jié)合區(qū)的研究已成功設(shè)計(jì)出幾類能夠特異性地與EGFR激酶區(qū)結(jié)合的酪氨酸激酶抑制劑。最具應(yīng)用前景的幾類化合物都是雜環(huán)衍生物,包括4-氨基喹唑啉衍生物,如化合物5(gefitinib,IC50=1.4nmol·L–1,分別于2002年與2003年在日本和美國(guó)上市,用于治療非小細(xì)胞肺癌)、6(erlotinib,IC50=1.0nmol·L–1),此類化合物有很強(qiáng)的抑制能力,而且有較高的選擇性;4-苯基胺基吡咯并嘧啶類化合物(如化合物7,IC50=4nmol·L–1),具有選擇性高、起效濃度低的特點(diǎn);4-芳基酰胺基吡啶并嘧啶類化合物(如化合物8,尚處于體外實(shí)驗(yàn))。酪氨酸激酶抑制劑研究較為深入,均具有抑制能力強(qiáng)、選擇性高等優(yōu)點(diǎn),目前,進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)的EGFR的小分子抑制劑有CI-1033、PKI166和GW572016等;gefitinib與erlotinib已進(jìn)入Ⅲ期臨床研究。有研究認(rèn)為,EGFRTK的ATP結(jié)合域可分為腺嘌呤結(jié)合區(qū)、疏水區(qū)Ⅰ、疏水區(qū)Ⅱ等五個(gè)區(qū)域;又發(fā)現(xiàn)喹唑啉類衍生物與EGFR作用時(shí),其疏水側(cè)鏈與ATP口袋的疏水區(qū)域的832位的Phe之間還存在π-π堆積相互作用,這表明相應(yīng)配體化合物應(yīng)具有苯環(huán)等疏水基團(tuán),使化合物與ATP口袋的疏水區(qū)作用時(shí),不僅存在疏水作用,還存在芳環(huán)π鍵作用,使化合物與酶的結(jié)合力更強(qiáng);又有通過對(duì)C-5位氨甲基取代的吡咯并嘧啶衍生物的EGFR抑制活性的研究結(jié)果支持了陽(yáng)離子基團(tuán)存在的必要性。他們認(rèn)為,化合物的C-5位取代基伸出ATP口袋,被質(zhì)子化的NH可能與酶表面的Asp831、Asn818的側(cè)鏈和Arg817主鏈上的羰基通過靜電力而產(chǎn)生相互作用,二者之間的陰陽(yáng)離子基團(tuán)的電性作用,可能影響抑制活性的強(qiáng)弱。3.1.3對(duì)伊馬替尼耐藥在小分子抑制劑方面,首先獲得成功的是伊馬替尼(imatinib,Gleevec)口服制劑。臨床研究證明可用于慢性髓性白血病(CML)及胃腸道基質(zhì)腫瘤(GIST)治療,但是長(zhǎng)期服用存在耐藥性問題。新一代的nilotinib由伊馬替尼經(jīng)分子結(jié)構(gòu)改造獲得,其作用強(qiáng)度提高30倍,對(duì)Bcr-Abl突變引起的伊馬替尼耐藥腫瘤有效。Dasatinib也屬同一類型的新藥,與nilotinib目前均尚在Il期臨床研究中。其他還有resveratrol(化合物15,IC50=123μmol·L–1inK562cells),piceatannol(化合物16,IC50=126μmol·L–1inK562cells)等。有研究采用計(jì)算機(jī)模擬了配體與受體的結(jié)合方式,在此基礎(chǔ)上作者對(duì)相關(guān)抑制劑結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,認(rèn)為化合物應(yīng)具備苯環(huán)、吡啶等疏水基團(tuán)以便化合物伸展在受體活性口袋內(nèi)部時(shí),可與受體疏水腔相關(guān)殘基產(chǎn)生范德華及疏水性相互作用,酰胺鍵及羰基等基團(tuán)可與受體形成穩(wěn)定氫鍵,促進(jìn)受體與配體的結(jié)合。在針對(duì)此靶點(diǎn)的抑制劑研究中,可以上述分析為參考開展研究工作,以提高活性、克服耐藥性。3.2外切酶法尼基化研究表明,Ras蛋白的生物學(xué)功能依賴于翻譯后的修飾,只有當(dāng)Ras蛋白結(jié)合到細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)后才具有生物活性。膜定位需要經(jīng)過法尼基化修飾,其過程主要有以下三步:Ras蛋白翻譯后在法尼基轉(zhuǎn)移酶(farnesyltransferase,Ftase)的催化下,將膽固醇合成途徑中的中間體法尼基焦磷酸酯(FPP)上的一個(gè)15碳的類異戊二烯基團(tuán)即法尼基(farnesyl)轉(zhuǎn)移到Ras蛋白的CAAX四肽結(jié)構(gòu)(C為半胱氨酸,A為脂肪族氨基酸,X為絲氨酸或蛋氨酸等)中的Cys殘基上(稱作法尼基化修飾);蛋白外切酶RCE1移去CAAX末端的三個(gè)氨基酸殘基;甲基轉(zhuǎn)移酶ICMT(isoprenylcysteinecarboxylmethyltransferase)甲基化新的羧基末端,最后將Ras蛋白定位于細(xì)胞膜,具有生物活性。3.2.1caisa類及雙底物抑制劑此類藥物包括CAAX競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、FPP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、雙底物抑制劑和金屬鋅離子螯合物等。其中CAAX競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑又分為肽類、擬肽類、非肽類抑制劑等,最先發(fā)現(xiàn)的CAAX競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑中的肽類抑制劑(化合物17,IC50=25~37nmol·L–1),由于肽鍵易水解或酶解,且羧基的負(fù)電性影響藥物的細(xì)胞透過性,活性較低;擬肽類抑制劑(化合物18,IC50=21nmol·L–1和化合物19,IC50=18nmol·L–1)提高了穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)活性,但藥動(dòng)學(xué)特征差;非肽類抑制劑(如化合物20、21、22,IC50分別為0.9nmol·L–1、0.86nmol·L–1和250nmol·L–1)克服了以上缺點(diǎn),比較穩(wěn)定且活性較高,因此近年來非肽類CAAX競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑發(fā)展較快,已有相關(guān)藥物進(jìn)入臨床。其他如FPP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(化合物23、24,IC50分別為1.2nmol·L–1和30nmol·L–1),雙底物抑制劑(化合物25,IC50=3800nmol·L–1),金屬鋅離子螯合物(化合物26,IC50=1.9μmol·L–1),均存在一些問題,要么活性不高,要么選擇性較差,如FPP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑及金屬鋅離子螯合物易導(dǎo)致較大的毒性、雙底物抑制劑極性較大,難以透過細(xì)胞膜且難以合成。所以CAAX競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑仍是研究的熱點(diǎn)。3.2.2ic50分子活性作用于RCE1的抑制劑,主要為多酰胺衍生物,如化合物27、28,其IC50分別為15μmol·L–1和11μmol·L–1,雖然具有一定的活性,但活性較低,且相對(duì)分子質(zhì)量過大。目前發(fā)展較慢。設(shè)計(jì)合成相對(duì)分子質(zhì)量較小、細(xì)胞透過性好、活性高的抑制劑可成為針對(duì)此酶的目標(biāo)。3.2.3普通法上的體外藥物活性化合物ICMT抑制劑通過抑制Ras蛋白定位于細(xì)胞膜前羧基的甲基化阻止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),最近報(bào)道以ICMT最小底物AFC(N-acetyl-S-farnesyl-L-cysteine)改造的吲哚類化合物對(duì)ICMT具有相應(yīng)的抑制活性,如化合物29(IC50=0.2μmol·L–1)、30(IC50=2.4μmol·L–1)。由于AFC發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚,相應(yīng)的抑制劑類型較少,但由于其作用的特殊性,有望成為抗腫瘤的有效靶點(diǎn)之一。3.3ras下游信號(hào)通道抑制劑針對(duì)Ras下游信號(hào)通路各靶點(diǎn)的化合物很多,其中以Raf抑制劑和PKC抑制劑的研究較為深入,有些已經(jīng)進(jìn)入臨床研究。3.3.1化合物的活性Raf激酶抑制劑從結(jié)構(gòu)上基本可以分為四類:脲類化合物及其生物電子等排體、雙苯基咪唑類化合物、苯甲酰胺類化合物和吲哚酮類化合物。其中脲類化合物是所有Raf激酶抑制劑中研究最多的一個(gè)類型(化合物31,IC50=73nmol·L–1)。有研究以X-射線衍射方法測(cè)定了化合物25的類似物Sorafenib,其吡啶環(huán)占據(jù)了ATP結(jié)合口袋并與3個(gè)芳香殘基作用,吡啶環(huán)上的N與Cys531中的NH形成氫鍵,酰胺取代基中的NH與Cys531骨架上的羰基形成另外一個(gè)氫鍵,其他重要的氫鍵還包括Sorafenib中的脲基團(tuán)與Glu500側(cè)鏈上的酯基以及Asp593骨架上的NH形成的氫鍵,Sorafenib中的三氟甲基基團(tuán)占據(jù)著另外一個(gè)口袋,這個(gè)口袋在Raf被活化時(shí)通常是由Phe594占據(jù)的。但此類化合物的水溶性較差,影響了其藥效的發(fā)揮,如果能在不影響生物活性的前提下增加藥物的水溶性將會(huì)提高其應(yīng)用價(jià)值。雙苯基咪唑類化合物對(duì)Raf-1激酶的抑制活性具有很高的選擇性,如化合物33即L-779450,能抑制多種細(xì)胞的增殖,具有很高選擇性。用呋喃異構(gòu)體以及吡咯替代結(jié)構(gòu)中的咪唑環(huán),也得到了較好的活性,如化合物34(對(duì)Colo-205、Colo-201和A375的IC50值分別為10、10和43nmol·L–1)。近年來發(fā)現(xiàn)苯甲酰胺類化合物(化合物35、36)和吲哚酮類化合物(化合物37,IC50=11nmol·L–1)也具有一定的活性,并發(fā)現(xiàn)采取前藥策略明顯有助于改善這類化合物的細(xì)胞活性。某些大環(huán)類化合物也顯示出較為明顯的抑制活性,如化合物38(IC50=1nmol·L–1),39(IC50=25nmol·L–1)。3.3.2化合物結(jié)構(gòu)活性目前已經(jīng)在植物、微生物和動(dòng)物的次生代謝物中篩選到很多具有PKC抑制活性的化合物,如苯乙醇苷類(化合物40,IC50=14.8μmol·L–1)、二苯乙烯(常要求兩個(gè)游離的酚羥基在同一個(gè)環(huán)上,化合物41,IC50=52nmol·L–1)、生物堿類(化合物42,IC50=0.66μmol·L–1)、多酚類(化合物43,IC50=16μmol·L–1)、黃酮類(化合物44)、二芳基庚烷類(化合物45,IC50=1.4μmol·L–1)和醌類(化合物46,IC50=4μmol·L–1)等。化合物47(IC50=1nmol·L–1)、48(IC50=10nmol·L–1)活性較高。另外,某些合成化合物也具有較好的抑制活性,如化合物49(IC50=1.6nmol·L–1)、化合物50(IC50=1.6μg·mL–1)。Ali等對(duì)此靶點(diǎn)的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究,如化合物51、52,可伸入結(jié)合位點(diǎn)穴內(nèi),C-2位的氨基可結(jié)合于Arg12、Glu35、Arg32,形成4~5個(gè)氫鍵,并由于范德華力增強(qiáng)了結(jié)合作用;N-3位無取代或以苯環(huán)取代的衍生物也有較好活性,如化合物53、54,其活性與N-3取代富電子的苯環(huán)與結(jié)合位點(diǎn)空穴產(chǎn)生靜電吸引力或N-3位氫鍵的形成有關(guān),所以C-2、N-3、N-10位的取代有利于活性的提高;化合物55的活性較低可能因?yàn)镹-3及N-10位疏水性取代基的存在影響了配體與空穴的結(jié)合;C-7,8,9位疏水基團(tuán)也會(huì)影響其與受體結(jié)合,而親水基團(tuán)由于可以形成氫鍵而提高活性;N-7位有H或苯環(huán),C-8位有氧原子或苯環(huán)將有利于活性,同樣與氫鍵的形成有關(guān)。3.3.3采用氮原子替換苯氧基化合物56(PD098059,IC50=100μmol·L–1)、57(U0126,IC50=50μmol·L–1),已進(jìn)入臨床。有研究對(duì)4-苯胺基-3-氰基-6,7-雙烷氧基喹啉類化合物進(jìn)行了構(gòu)效分析,化合物58中4-苯胺基上對(duì)位以苯氧基取代有較好活性(IC50=0.0062μmol·L–1),以氮原子替換苯氧基中的氧,活性明顯降低,如化合物59(IC50=0.16μmol·L–1),而以亞甲基替換苯氧基中的氧,活性可保持同樣水平,如化合物60(IC50=0.0036μmol·L–1),這說明氫鍵給體的存在對(duì)活性不利;苯胺基上有取代時(shí),兩個(gè)苯環(huán)之間構(gòu)象應(yīng)有一定剛性,兩個(gè)苯環(huán)直接相連,活性遠(yuǎn)大于兩苯環(huán)間以柔性基團(tuán)相連的化合物;苯胺基上取代基團(tuán)的大小對(duì)活性也至關(guān)重要,如以甲氧基、羥基、甲巰基替換苯氧基,活性明顯降低;苯氧基從對(duì)位換至間位時(shí),活性也會(huì)降低,換至鄰位降低更明顯;苯胺基上取代基以不飽和基團(tuán)為優(yōu),如化合物61(IC50=0.0024μmol·L–1)、化合物62(IC50=0.0027μmol·L–1)、化合物63(IC50=0.0011μmol·L–1),取代基分別為苯氧基、苯基和苯硫基,其活性明顯高于化合物64(IC50=0.11μmol·L–1)。3.3.4-5-吡啶-4-基蒂唑外施物目前p38MAPK抑制劑已發(fā)展到第二代,且具有廣泛的用途,選擇性更高,效力更強(qiáng),以咪唑類衍生物為主。咪唑類化合物均含有4-芳基-5-(吡啶-4-基)咪唑結(jié)構(gòu),靠近吡啶基團(tuán)的N上及C-2位取代不影響活性(如SKF86002,SB220025,SB203580),而靠近芳環(huán)的N上的取代則相反;咪唑基可以呋喃、吡咯、吡唑啉基替換,以吡咯基團(tuán)活性最好;將C-4位吡啶基(如SB203580,IC50=48nmol·L–1)替換為嘧啶,有利于提高體外及體內(nèi)活性(如SB220025,IC50=19nmol·L–1)。3.3.5化合物的合成JNK抑制劑較早從天然產(chǎn)物中分離改造得到,如化合物CEP-1347(化合物68,IC50=20nmol·L–1),發(fā)展到現(xiàn)在已設(shè)計(jì)合成了大量小分子化合物。針對(duì)JNK不同亞型,抑制劑也有不同,如針對(duì)JNK3的2-乙腈苯并噻唑衍生物(化合物69,IC50=250nmol·L–1和70,IC50=9400nmol·L–1)。嘧啶基附近有吸電子基團(tuán)可提高活性,將嘧啶基上的N替換成C則活性降低,乙腈基也可以替換為其他具有一定體積的吸電子基團(tuán);苯并噻唑上的-NH附近連接給電子基有利于活性。2′-苯胺基-4,4′-雙吡啶類化合物也是針對(duì)JNK3的抑制劑,如化合物71(IC50=32nmol·L–1),2′-苯胺基部分結(jié)合于激酶的選擇性口袋內(nèi),Met146的甲基硫代乙基鏈移開以便配體的苯環(huán)與受體的結(jié)合,吡啶環(huán)上的N以及苯胺基旁的NH鍵可與Met149形成氫鍵。另有雜環(huán)醌類化合物如SP600125(化合物72,IC50=40nmol·L–1)。3.3.6其他方面化合物在PI3K的抑制劑中,主要有靶向PI3K的催化亞基pll0的抑制劑,以Wortmannin(化合物73,IC50=3nmol·L–1)和LY294002(化合物74,IC50=1400nmol·L–1)為代表,但由于水溶性差且毒性較強(qiáng)等原因,限制了其進(jìn)一步開發(fā)。另外一種亞基異構(gòu)型特異性抑制劑,可特異性針對(duì)p110δ催化亞單位的異構(gòu)型。其他幾類化合物分別以PI-1