wn信號通路與腫瘤的關系

wn信號通路與腫瘤的關系

1982年，自nussse等人發(fā)現wnt-1基因以來，發(fā)現并克隆了19種wnt基因家族的成員。通過wnt基因指南，確定網絡路徑為wnt信號路。早期研究已證實Wnt信號途徑是一種進化上高度保守、對控制胚胎發(fā)育有重要作用的信號傳導通路。近十多年來對Wnt基因家族成員的編碼產物及其生物學效應的研究發(fā)現Wnt信號通路的異常激活參與多種人類癌癥的發(fā)病,如β-catenin的致癌性突變,或APC的失活性突變,這些突變均可導致Wnt途徑的異?；罨透鞣N腫瘤發(fā)生。1nt信號通道1.1安全性抑制劑的作用機制Wnt/β-catenin信號傳導是一條極為保守的信號通路,利用分子生物學和基因學相結合的手段對Wnt途徑進行研究發(fā)現Wnt途徑的主要組成成員包括:Wnt家族分泌性相關蛋白(Wnt)、跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled,Frz)、輔助性受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(lowdensitylipoproteinreceptorrelatedprotein5/6,LRP5/6)、松散蛋白(Dishevelled,Dsh,Dvl)、酪蛋白激酶1(carseinkinase1,CK1)、糖原合成酶激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β,GSK-3β)、結直腸腺瘤性息肉(adenomatouspolyposiscoli,APC)蛋白、軸蛋白(Axin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、核內轉錄因子T細胞因子(Tcellfactor,TCF)/淋巴樣增強因子(lymphoidenhancingfactor,LEF)家族。其具體過程為(圖1):胞膜外配體Wnts蛋白同時與7次細胞跨膜的Frezzled受體和輔助性受體LRP5/6結合后開啟Wnt/β-catenin信號通路的傳導,并活化胞質內Dsh蛋白,活化的Dsh蛋白能抑制由APC蛋白、GSK-3β、Axin、β-catenin等形成的降解復合體中關鍵成分GSK-3β的活性,使β-catenin不被GSK-3β磷酸化從而避免了泛素蛋白酶體對其識別和降解,進而在胞質中逐漸積聚。當β-catenin在胞漿中積聚到一定濃度時就開始向細胞核轉移,并與胞核內的轉錄因子TCF/LEFs結合導致β-catenin的下游靶基因的啟動因子暴露出來而被激活表達,如激活c-myc、cyclinD1、survin、gastrin、VEGF、ASEF等而導致細胞異常增殖。在正常成體細胞中,胞質內的β-catenin大部分與胞膜粘附蛋白E-cadherin及α-catenin結合形成復合體參與細胞骨架的調節(jié),維持同型細胞的粘附,防止細胞轉移,少部分游離的β-catenin在胞漿內被降解復合體磷酸化后由泛素蛋白酶體識別并降解,保持胞內β-catenin低水平狀態(tài)。顯然,β-catenin在這條信號通路中扮演著極其重要的的作用,是整條通路的關鍵樞紐分子,它由胞漿向胞核的轉位被認為是該信號通路被激活后行使功能的標志。1.2分情況下是否獨立發(fā)揮作用腫瘤信號通路是一個非常復雜的網絡系統(tǒng),大部分情況下并非獨立發(fā)揮作用。同樣Wnt信號通路的在腫瘤形成過程中的傳導或轉錄調控機制是通過和其他的信號通路之間的“通訊”得以實現的。1.2.1smad4/p-smad3/sbes復合材料的制備轉化生長因子β(TGF-β)激活TGF-β受體后,被激活的TGF-β受體磷酸化胞漿中限制性通路的Smad蛋白(Smad3),這些蛋白能與公共介質Smad蛋白(Smad4)相結合形成Smad4/p-Smad3復合物異位到胞核,進入核內的Smad4/p-Smad3復合物又和與LEFI/TCF相毗連的SBEs(Smad-bindingelement)結合形成Smad4/p-Smad3/SBEs復合物。Smad4/pSmad3/SBEs復合物可以直接與轉錄因子LEFI/TCF啟動靶基因的轉錄表達,也可以在β-catenin的參與下和LEFI/TCF結合形成β-catenin/LEF/Smad4/Smad3/SBEs復合物,與Wnt/β-cateinin通路共同激活下游靶基因的轉錄表達,因此,Wnt既可以獨立又可在細胞核內與TGF-β協(xié)同調節(jié)靶基因表達。1.2.2-catenin物理特征Lamberti等在結腸癌細胞內發(fā)現NF-кB通路成員IкB激酶α(IкBkinaseα,IKKα)能增加Wnt信號通路中核內Tcf/Lef/β-catenin復合物的轉錄活性。同樣,Wnt通路中某些成員也參與對NF-кB的調控。Deng等發(fā)現大腸癌細胞內的活化游離狀β-catenin可與NF-кB結合形成復合物而抑制NF-кB的活性,減弱NF-кB與DNA的結合能力,降低NF-кB信號通路下游靶基因的轉錄表達水平,如基因Fas和TRAF1。Hoeflich等還發(fā)現Wnt通路成員GSK-3β可通過磷酸化NF-кB亞基RelA促進NF-кB核內轉移并上調NF-кB對其靶基因的轉錄激活能力。1.2.3egfr通路結構多條信號通路又可相互交叉通訊,如Wnt信號通路和COX-2信號通路及EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)信號通路之間也存在復雜的信號網絡“通訊”。Castellone等在體外結腸癌細胞研究中精確的闡述了Wnt、COX-2及EGFR通路之間的信號網路交叉關系(圖2),COX-2的生物活性產物前列腺素2(PGE2)能增強核內Tcf/Lef/β-catenin復合物啟動下游靶基因轉錄的活性,而且還能激活Wnt信號通路某些成員蛋白的信號傳遞功能,解散“降解復合體”而無法磷酸化β-catenin。PGE2活化Wnt信號通路并非通過PKA-cAMP信號途徑,而是通過COX-2通路成員Gαs與Wnt通路成員Axin的直接相互作用得以實現的。Gαs的GTP活性結構區(qū)與Axin的RGS(regulatorofGproteinsignaling)區(qū)結合后使Axin無法結合到“降解復合體”中,從而激活Wnt信號下游通路。另一重要的發(fā)現是,PGE2還可通過EGFR/Akt/PKB(proteinkinaseB)途徑對GSK-3β的第9絲氨酸進行磷酸化,使GSK-3β失活而不能磷酸化胞漿內的β-catenin。2wnt基因Wnt途徑的異?；罨诩毎┳儭⒛[瘤發(fā)生及腫瘤侵襲性過程中具有重要作用,當Wnt基因本身或通路其他任一成員因素發(fā)生變化使其不正?；罨瘯r,均有可能引起腫瘤的發(fā)生。2.1wnt基因表達研究顯示,已發(fā)現在人類多種惡性腫瘤中存在異常Wnt蛋白信號。Iozzo等通過對100多份正常和腫瘤組織及10個人類腫瘤細胞系的研究發(fā)現在乳腺癌、肺癌、前列腺癌及黑色素瘤中均存在Wnt-5aamRNA的過度表達,尤其是在乳腺癌中的表達異常明顯。另外有報告指出Wnt蛋白拮抗劑分泌相關性曲卷蛋白SFRP-1(secretedfrizzled-relatedprotein-1)和SFRP-5的后天性失活與人類乳腺癌癥及其預后密切相關。胞內Wnt抑制因子WIF-1(Wntinhibitoryfactor-1)減少或WIN基因的甲基化突變均可誘發(fā)食管癌和鼻咽癌及垂體瘤。Queimado等首次在人體涎腺癌細胞中發(fā)現WIF1因子表達下調和Wnt1蛋白表達上調。2.2apc基因突變β-catenin基因的突變可避免降解復合體中的GSK-3β和CK1對其磷酸化從而激活下游通路。β-catenin的突變在許多腫瘤的形成中起重要作用。在結直腸癌、甲狀腺癌、肝癌、卵巢癌細胞中檢測到β-catenin突變率高達50%以上,胃癌細胞中β-catenin突變率也近300%。Mikami等在310例早期結直腸癌中發(fā)現220例存在β-catenin基因突變。XiaJ等7位日本研究學者在32例基質瘤中有61%(14/23)存在β-catenin第三外顯子突變。APC基因是1種與人類許多腫瘤密切相關的抑癌基因,是β-catenin的負性調節(jié)因子。APC的突變可導致結腸上皮細胞過度增生形成息肉,并可逐漸惡變成結腸癌。約85%的結腸癌與APC基因的突變或失活有關。Csepregi等在50例肝臟腫瘤中發(fā)現有29例(63.1%)存在APC基因啟動子甲基化使APC蛋白表達過低。Axin基因作為Wnt信號通路的負性調節(jié)因子抑制腫瘤的發(fā)生,Axin基因在肝癌細胞中存在較高的突變率,通過直接DNA測序法發(fā)現36例肝細胞癌合并肝硬化患者中有9例存在Axin1第3～5外顯子基因突變。檢測陽性率達25%,24例肝癌細胞中缺乏Axin蛋白或表達水平降低,陽性率高達66.7%。FZD受體的異常表達可見于多種惡性腫瘤,消化道腫瘤細胞中FZD表達明顯高于正常粘膜組織,不同胃癌細胞株中就存在FZD家族多個成員的異常表達。To等在12例胃癌標本中檢測發(fā)現有9例FZD3表達上調。在非小細胞肺癌中也同樣發(fā)現異常高表達的Wnt7a/Fzd9復合物。Disheveled蛋白是和FZD受體一樣,也是Wnt通路的正性調節(jié)因子,Dsh蛋白的異常過多表達在一些腫瘤細胞中被檢測到。Nagahata等在24例果蠅乳腺癌中發(fā)現有13例DVL-1基因異常擴增,其中11例DVL蛋白異常表達。98例人類浸潤性乳腺導管癌組織細胞中30%檢測到胞漿或核內存在disheveled蛋白異常表達。GSK-3β是通路的負性調節(jié)因子,其異常突變或失活可活化Wnt信號通路而引起與腫瘤發(fā)生。Farago等設計好一段鼠類糖原合成酶激酶失活激酶KI-mGSK3β(kinase-inactivemurineglycogensynthasekinase3β)cDNA,并將其轉然入人類乳腺組織上皮細胞中,隨后發(fā)現KI-mGSK3β使GSK-3β失活而誘發(fā)乳腺上皮細胞癌變。3阻斷異常的wnt信號通路對腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡Wnt信號通路的異常活化在細胞癌變、腫瘤發(fā)生及腫瘤侵襲性過程中具有重要作用,阻斷異常的Wnt信號通路可以抑制腫瘤細胞增殖,誘導腫瘤細胞凋亡。因此Wnt信號通路具有較好的抗腫瘤靶向作用,目前針對Wnt信號通路為靶點的抗腫瘤治療包括以下幾個方面。3.1外源性sfrp抑制劑近年來,隨著對抗腫瘤藥物曲妥單抗(trastuzumab)的研發(fā)成功后,人們對生長因子及其膜外受體的靶點腫瘤治療研究越發(fā)感興趣。因此,我們可以大膽設想Wnt蛋白本身及其受體可作為腫瘤藥物治療的靶點。已有報告稱單克隆抗Wnt-1抗體作用于非小細胞肺癌、乳腺癌、間皮瘤及肉瘤可抑制Wnt配體與胞膜受體結合,引起Wnt通路下游蛋白改變,誘導腫瘤細胞凋亡,且這種單抗體在活體內同樣具有抗腫瘤作用。Mazieres等通過siRNA技術和單克隆抗Wnt-2抗體抑制人體惡性間皮瘤細胞Wnt-2蛋白,達到抑制腫瘤細胞增殖,誘導細胞凋亡的作用。Wnt受體拮抗劑根據作用方式分2類:①直接抑制Wnt配體與FZD受體結合而抑制Wnt信號傳導,如分泌型曲卷相關蛋白家族sFRPs(secretedfrizzled-relatedproteins)和Wnt抑制因子WIF(Wntinhibitoryfactor)等;②通過結合LRP5/6抑制Wnt信號傳導,如DKK家族(Dickkopf)。sFRPs也屬于分泌性蛋白,結構上與富含半氨酸結構域CRD的FZD高度同源,在Wnt信號過度活化時sFRP可結合Wnt蛋白競爭性抑制FZD與Wnt蛋白結合,從而抑制腫瘤的形成和發(fā)展并促進細胞凋亡。sFRP基因的甲基化沉默與許多腫瘤的形成有關,將sFRP基因轉染入sFRP低表達的間皮瘤細胞株可抑制腫瘤細胞增長,并誘導細胞凋亡。在結腸癌中,同樣證實sFRP基因及其表達蛋白的功能復活能抑制Wnt信號通路,即使通路下游的某些成員已經突變。這些研究均表明外源性sFRP能起到有效抑制腫瘤細胞增殖分化作用。WIF通過直接與Wnt蛋白結合而抑制Wnt蛋白活性,阻斷Wnt信號的進一步傳導。Kim等將包含基因WIF的基因載體轉染入人細胞癌細胞株A549和H460中,并將其植入小鼠模型,發(fā)現WIF對活體內和活體外肺癌細胞都具有抑制作用。最近正在探討開發(fā)一種具有抗腫瘤潛能的DKK蛋白也是1種分泌性糖蛋白,DKK通過抑制Wnt與輔助性受體LRP5/6結合而抑制Wnt通路。至今,人體內已經確定的DKK蛋白有4種,分別命名為DKK-1、DKK-2、DKK-3和DKK-4。早期的非小細胞肺癌中DKK-3的表達水平明顯下調,Hoang等研究發(fā)現人骨肉瘤細胞中DKK-3能抑制Wnt通路,誘導β-catenin與粘附蛋白結合,重新定位到細胞膜上,從而有效抑制腫瘤的侵襲性和轉移能力。人惡性膠質瘤細胞株U87MG未發(fā)現到DKK-1,通過基因處理使其表達適當水平的DKK-1后,再用氮芥和順鉑類化療藥物處理,發(fā)現誘導腫瘤細胞凋亡程度明顯強于無DKK-1表達組。提示DKK-1可作為化療藥物的輔助藥物提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。最近又有報告稱DKK-1可降低人類乳腺癌患病率,提示DKK-1可能還起到預防腫瘤的作用。3.2山西氣調因子axinWnt信號通路是一條通過胞內許多成員蛋白之間相互作用而向下傳導的非直線性通路,其中許多成員是Wnt/β-catenin信號通路中的負性調控因子,發(fā)揮腫瘤抑制作用。APC的β-catenin結合區(qū)可作為抗腫瘤靶點抑制腫瘤,將重組腺病毒Ad-CBR(arecombinantadenovirus)植入結腸癌細胞(APC突變,野生型β-catenin)后,Ad-CBR阻止β-catenin進入核內,抑制β-catenin與轉錄因子TCF/LEFs結合,從而抑制細胞生長并誘導其凋亡。Wnt信號通路負性調節(jié)因子Axin同樣也是抗腫瘤治療的一個靶點,將載有野生型Axin-1的腺病毒植入伴有APC突變或CTNNB1突變或Axin-1突變的肝癌細胞和結腸癌細胞后,能誘導腫瘤細胞凋亡。最近研究發(fā)現,一種絲氨酸-蘇氨酸磷酸蛋白激酶(PP1)抑制劑能促進CK1對Axin的某些特定位點磷酸化,使磷酸化的Axin更易于結合到β-catenin降解復合體上,從而促進β-catenin被降解。類似的Wnt信號通路負性調節(jié)因子GSK-3β、CK1等理論上也具有抑制腫瘤的作用,或許是未來研究腫瘤靶點治療的熱門領域。3.3胞核轉位和方向如前所述,Wnt信號通路中關鍵樞紐分子β-catenin由胞漿向胞核的轉位是該信號通路被激活后行使功能的標志。實驗證明,降低胞漿內β-catenin水平及抑制胞漿內β-catenin向核內轉移能有效抑制腫瘤。因此,β-catenin是抗癌治療研究的重要分子靶位。3.3.1抗炎與基因靶向位點的研究近十多年來,反義RNA技術越來越成熟普及化。至今,通過反義RNA封閉靶點基因功能而研發(fā)的臨床試驗藥物已超過20種,如bcl-2、c-Myc、H-ras的反義寡聚核苷酸(antisenseoligonucleotides)治療淋巴瘤、白血病和其他惡性腫瘤。反義寡聚核苷酸是一條人工設計的單鏈DNA或RNA或DNA/RNA嵌合體,能特異性地與目的mRNA鏈互補結合,在空間上妨礙以此mRNA為模板的蛋白質合成,在翻譯調控水平抑制蛋白表達。反義寡聚核苷酸研發(fā)在臨床試驗中的成功暗示通過反義寡聚核苷酸封閉β-catenin基因轉錄表達功能同樣具有可行性。為此,國內外許多研究學者已證實β-catenin基因具有反義寡聚核苷酸和RNA干涉的靶向位點。Green等發(fā)現,反義寡聚核苷酸能阻擾結腸癌細胞β-cateninmRNA功能,降低結腸癌胞漿內β-catenin蛋白表達水平,從而抑制β-catenin進入核內與轉錄因子結合啟動下游靶基因轉錄,且反義寡聚核苷酸對結腸癌的這中抑制作用呈劑量依賴性。類似的試驗在研究食道癌細胞也有相同結果,同樣用反義寡聚核苷酸處理5類食道癌細胞系,出現50%以上的β-cateninmRNA功能受限和β-catenin蛋白表達減少。和反義RNA類似,RNA干涉技術(RNAinterference,RNAi)可在腫瘤細胞中通過沉默β-catenin基因達到抑制β-catenin蛋白表達的目的。這幾年,一些研究學者已陸續(xù)發(fā)表過相關文章,進一步證實了通過RNAi技術抑制胞漿β-catenin蛋白表達,從而達到腫瘤分子靶點治療的抗癌目的。小干涉性RNA(smallinterferingRNA,siRNA)處理的結腸癌細胞株SW480和HCT11648小時后,出現胞漿β-catenin蛋白表達水平明顯降低,核內β-catenin/TCF復合物也相應減少,且這種抑制作用可持續(xù)10天以上。同樣的結果也出現在HeLa細胞株中。GangZeng等將β-catenin小干涉性RNA轉染入肝癌細胞HepG2(β-catenin基因突變)和Hep3B(β-catenin基因未突變)后,β-catenin蛋白表達水平明顯降低,而且Wnt信號通路下游靶基因如cyclinD1的轉錄表達也明顯受限。盡管類似的結果在活體實驗研究報告并不是很多,但利用RNAi技術沉默β-catenin基因發(fā)揮有效抗癌治療作用的潛能非常大。相比較成熟的反義RNA技術,未來生物技術研究RNAi技術還有待進一步提高。3.3.2維持胞內“-catenin庫”平衡,激活下游靶基因促進胞漿游離狀β-catenin被降解,維持細胞內“β-catenin庫”平衡。如前所述,胞內“β-catenin庫”平衡被破壞致使胞漿內游離態(tài)β-catenin逐漸增多,最終進入核內激活下游靶基因轉錄表達。因此,促進游離態(tài)β-catenin被降解,減少胞漿內活化狀β-catenin,維持胞內“β-catenin庫”平衡,從而抑制β-catenin進而核內激活下游靶基因轉錄,發(fā)揮抗癌治療作用。Cong等通過人工設計,將E-cadherin的β-catenin結合區(qū)整合入一嵌合蛋白融合成β-TrCP泛素蛋白連接酶,再將此蛋白植入DLD1結腸癌細胞株中,發(fā)現胞漿內游離態(tài)β-catenin被泛素蛋白酶體泛素化和被降解率明顯增高,DLD1細胞克隆增生也明顯受限,且在隨后的裸鼠試驗中能抑制腫瘤生長。SU等設計了包含多個APC蛋白第15位氨基酸重復單位的嵌合體F蛋白盒(CFP),將此蛋白盒植入結腸癌細胞后發(fā)現,胞漿內游離β-catenin不需經降解復合體磷酸化便可被泛素蛋白酶體發(fā)現并降解,提高了β-catenin的降解率,抑制其進入核內激活下游靶基因轉錄。近來有研究報告稱,鈣周期結合蛋白(calcyclin-bindingprotein,CacyBP)能降低胃癌細胞胞漿和核內β-cateni