精液冷凍保護(hù)液中甘油卵黃配伍的實(shí)驗(yàn)研究

精液冷凍保護(hù)液中甘油卵黃配伍的實(shí)驗(yàn)研究

甘草-黃酮是迄今為止最好的抗旱性藥物保護(hù)溶液，但甘草和黃酮的劑量、制備方法和用量不同。本文通過(guò)17項(xiàng)實(shí)驗(yàn),對(duì)冷凍保護(hù)液(CPM)中甘油、卵黃的最佳用量、配伍方法及與精液的比例對(duì)精子存活率(SSR)的影響做了比較性研究,試圖尋找本精子庫(kù)條件下甘油-卵黃復(fù)合液的最佳配伍和使用方法。材料和方法基本材料和方法同“人精子超低溫凍貯技術(shù)的研究(一)”文。不同之處在各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中解釋注明。結(jié)果一、方差分析實(shí)驗(yàn)共用12份精液標(biāo)本。保護(hù)液配制后6h內(nèi)使用,一次完成冷凍實(shí)驗(yàn)。按CPM中卵黃濃度不同,每份精液分4組(CPM及分組見(jiàn)表1)。精液液化后分別加入等量、同溫CPM(精液:CPM=1:1),充分混勻后,安瓿法分裝。采用速凍法降溫冷凍,即將裝入混合精液的安瓿移至液氮蒸氣中,先以約3℃/min的速率降溫至-30℃,改用約8～10℃/min的速率降溫至-80℃以下,然后凍存在-196℃液氮中。37℃水浴復(fù)溫后,2人光鏡鏡檢SSR。數(shù)據(jù)做方差分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果表明,4組間平均SSR最大差為9.9%,但差異無(wú)顯著性(P>0.05)。二、不同的冷凍法對(duì)ssr的影響實(shí)驗(yàn)共用10份精液標(biāo)本。CPM中卵黃濃度均為30%。按甘油濃度不同,每份精液分4組(CPM及分組見(jiàn)表2),其它方法同一。三、降溫速率ssr實(shí)驗(yàn)共用10份精液標(biāo)本。CPM同二,(配方及分組見(jiàn)表2)。采用緩凍法冷凍。精液添加CPM后分裝入安瓿,先移入-12～-15℃冰箱內(nèi)冷平衡10min,然后移至液氮蒸氣中降溫冷凍,降溫速率及其它方法同二。結(jié)果表明,4組間SSR最大差為5.8%,差異有顯著性(0.01<P<0.05)。14%和15%甘油兩組平均SSR差異無(wú)顯著性(P>0.05)。四、酒精的分組及比例實(shí)驗(yàn)共用10份精液標(biāo)本。CPM中甘油濃度14%,卵黃濃度20%。按精液與CPM的比例不同,每份精液分為5組(分組及比例見(jiàn)表3)。其它方法同一。結(jié)果表明,5組間平均SSR最大差為18.6%,差異有極顯著性(P<0.01)。兩兩比較結(jié)果表明,1～4組間SSR最大差為7.8%,差異無(wú)顯著性(P>0.05),但與第5組之間SSR差為10.8～18.6%,差異有極顯著性(P<0.01)。不同供精用量的精子密度和其致孕量影響因素的研究結(jié)果甘油屬小分子膜內(nèi)保護(hù)劑,添加到精液中可迅速滲透到精子細(xì)胞內(nèi),降低其冰點(diǎn),減少冰晶形成,防止細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃縮、紊亂。卵黃含有多種大分子物質(zhì),屬膜外保護(hù)劑。一般認(rèn)為,它可附著在精子細(xì)胞表而,調(diào)整降溫及復(fù)溫過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)、外電解質(zhì)濃度的驟變,減輕冷凍引起的精子“溫度休克”,提高復(fù)溫后精子存活率及其致孕力。甘油與卵黃配伍使用可同時(shí)發(fā)揮膜內(nèi)、外協(xié)同保護(hù)作用,最大程度地減少精子的凍害損傷。作者既往的研究表明,不論速凍法或緩凍法凍貯人精子,同樣條件下,加用卵黃的甘油復(fù)合液凍貯效果較好。澤田喜彰曾用10～50%卵黃與10～20%甘油配伍組合,比較篩選最佳甘油與卵黃配伍濃度。結(jié)果證實(shí),卵黃和甘油在精液中的最終濃度分別為15%和6～7%時(shí),其保護(hù)效果最佳。卵黃和甘油最終濃度分別為10%和7～8%者次之。本文結(jié)果表明,甘油最終濃度為7%時(shí),采用10%卵黃效果最好,15%卵黃次之。卵黃最終濃度于20%時(shí),保護(hù)效果較差。作者在配制和使用卵黃復(fù)合液時(shí)發(fā)現(xiàn),卵黃濃度高于40%時(shí),發(fā)生部分性凝聚樣變,難以與復(fù)合液中其它物質(zhì)均勻地溶合在一起,而是形成大小不等的顆粒樣懸浮或沉淀物。作者推斷,使用高濃度卵黃復(fù)合液時(shí),保護(hù)劑成份不均等,可能是影響保護(hù)效果的重要因素。甘油濃度是影響精子存活率的關(guān)鍵因素之一。作者既往的研究表明,最終濃度為10%的卵黃與7%甘油配伍,保護(hù)效果最佳。本文采用速凍法和緩凍法對(duì)照比較,結(jié)果與澤田喜彰的研究結(jié)果相同。兩種冷凍方法均以7～7.5%甘油為佳。鑒于效果相近,作者所在精子庫(kù)常規(guī)采用14%甘油和20%卵黃復(fù)合液凍貯精液行人工授精。關(guān)于甘油復(fù)合液使用方法的研究報(bào)道甚少。沿用的方法是將CPM等量添加至精液內(nèi)。即精液:CPM=1:1。眾所周知,生育力正常者的某次精液可受時(shí)間、地點(diǎn)、精神因素等影響,差異甚大;不同的個(gè)體之間精液質(zhì)量也有較大的差異。例如:每份“正常精液”的精子密度可在6～20×108/L之間;精子活動(dòng)率可在60～85%之間。因此,同一供精者不同次數(shù)的供精,以及供精者個(gè)體之間的供精質(zhì)量必然有一定的差異。不同質(zhì)量的凍精用于人工授精,其致孕效果也必然不同。畜牧業(yè)精液凍貯(例如牛精液)時(shí),力求通過(guò)使用不同量的CPM,調(diào)整每份凍精單位體積內(nèi)所含的精子數(shù)量或活精子數(shù)量大致相同,以圖使凍精規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化,以便觀察比較凍精人工授精的效果。本文試圖尋找同一保護(hù)液的最佳用量,以便解決每份供精精子密度和/或精子活率差異不同的問(wèn)題,以便使供精冷凍后標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化,提高并比較不同供精的致孕力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CPM用量為精液的0.7～2倍時(shí),其保護(hù)效果較好。CPM用量較精液大或小于2倍時(shí),保護(hù)效果變差。原因可能是CPM用量過(guò)大或過(guò)小時(shí),精液中的甘油最終濃度相對(duì)過(guò)高或過(guò)低所致。根