生物反應(yīng)器規(guī)模放大的基本原理

反應(yīng)器放大的目的是增加產(chǎn)量，同時保持相似的產(chǎn)品質(zhì)量。這意味著必須跨規(guī)模保持相當(dāng)?shù)募?xì)胞特異性生產(chǎn)力、細(xì)胞密度和活性以及細(xì)胞代謝。為了實現(xiàn)這一點，盡可能多的操作參數(shù)必須保持不變。

在工藝放大過程中，溫度、pH、溶氧設(shè)定點和補(bǔ)液策略等與規(guī)模無關(guān)的變量很容易保持不變（表1）。然而，與規(guī)模相關(guān)的參數(shù)，如攪拌、葉輪葉尖速度、混合時間、雷諾數(shù)和通氣流速，在整個放大過程中不能同時保持不變。這是因為它們對攪拌速度、葉輪直徑和容器直徑具有不同的依賴性。最終，這些參數(shù)會影響運(yùn)營成本、培養(yǎng)異質(zhì)性、氣體轉(zhuǎn)移特性以及施加于細(xì)胞的剪切應(yīng)力。從本質(zhì)上講，生物反應(yīng)器的放大涉及多方面的權(quán)衡和妥協(xié)。表1規(guī)模無關(guān)變量和規(guī)模依賴性變量雖然攪拌罐生物反應(yīng)器的體積功率輸入通常保持在10-80W/m3的范圍內(nèi)，但其它因素，即混合速度、混合時間、葉輪葉尖速度和雷諾數(shù)，根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模的不同而有不同的值。如（表2）所示，攪拌速度隨著規(guī)模的增加而降低。然而，由于葉輪尺寸增加，葉輪葉尖速度和雷諾數(shù)遵循相反的趨勢。最后，由于容器直徑的增加，混合時間也隨著規(guī)模的增加而增加。表2不同生產(chǎn)規(guī)模下規(guī)模相關(guān)參數(shù)的典型值Part1、幾何相似性

幾何相似性通常是用于放大生物反應(yīng)器的第一個標(biāo)準(zhǔn)。如果罐直徑增加，所有其它長度（罐高度、葉輪直徑和葉輪寬度）都會增加相同的比例因子。一般來說，用于細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器罐的高徑比(H/D)對于臺式生物反應(yīng)器為1-2，對于中試和工業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器為2-3。然而，保持H/D會影響與表面和體積相關(guān)的因素，例如熱傳遞、氣體傳遞和混合。由于在罐壁上發(fā)生熱交換，每單位體積的熱傳遞隨著體積的增加而減少。恒定的H/D縱橫比也將顯著降低表面積與體積比(Ac/V)，從而降低表面通氣對O2和CO2汽提的貢獻(xiàn)。因為氣體傳輸速率的重要性以及對混合速度和氣體流速的限制，這對于剪切敏感細(xì)胞至關(guān)重要。Part2、動力學(xué)相似性和規(guī)模放大標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)所有相關(guān)力的比率在不同規(guī)模上保持不變時，就會存在動態(tài)相似性，從而導(dǎo)致，例如，相似的流場。在放大過程中，必須根據(jù)對細(xì)胞培養(yǎng)性能影響最大的因素來選擇標(biāo)準(zhǔn)。由于相互依賴性，當(dāng)一個關(guān)鍵參數(shù)保持不變時，其它因素可能會隨著體積的增加而出現(xiàn)顯著變化，這可能會導(dǎo)致在較小規(guī)模下沒有遇到的問題。對于攪拌罐采用的一些最常見的放大標(biāo)準(zhǔn)，可以在（表3）中看到關(guān)鍵的相互依賴的變量。例如，在放大過程中保持恒定的體積功率輸入將轉(zhuǎn)化為最大剪切速率的增加（從更大的尖端速度）和攪拌速度的降低。反過來，降低的攪拌速度將導(dǎo)致混合時間增加，可能導(dǎo)致不希望出現(xiàn)的環(huán)境異質(zhì)性。在放大過程中恒定的葉輪葉尖速度或恒定的雷諾數(shù)（即類似的流體動力學(xué)狀態(tài)）也意味著混合速度降低。表3當(dāng)容器直徑增加5倍時幾何相似生物反應(yīng)器放大參數(shù)的相互依賴關(guān)系。每列中的1表示在大規(guī)模條件下保存。在剪切敏感細(xì)胞的情況下，可以使用恒定的葉輪葉尖速度；然而，體積功率的降低必須通過更高的氣體流速來補(bǔ)償，以保持可接受的氧氣傳輸率，這也可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷。此外，保持恒定葉輪葉尖速度所需的較低混合速度將導(dǎo)致大規(guī)模條件下混合較差。因此，葉輪葉尖速度可能不是生產(chǎn)體積差異較大時的合適放大標(biāo)準(zhǔn)。放大期間恒定的混合時間將導(dǎo)致葉輪葉尖速度增加，這可能導(dǎo)致細(xì)胞損壞，以及功率的極大增加。氧氣傳輸、混合和適當(dāng)?shù)腃O2汽提通常被認(rèn)為是生物反應(yīng)器放大過程中最重要的因素。因此，對于CHO細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)的放大，最常選擇對氣體傳輸和混合的影響最小化的標(biāo)準(zhǔn)。Part3CHO細(xì)胞培養(yǎng)的常見規(guī)模放大策略

在本節(jié)中，將介紹用于在生物反應(yīng)器中放大CHO細(xì)胞培養(yǎng)的最常見策略，并討論它們的含義。（表4）概述了最近評估不同規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)性能的研究，以及所采用的規(guī)?？s放標(biāo)準(zhǔn)。表4CHO細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模放大標(biāo)準(zhǔn)示例Part4恒定體積功率輸入

使用恒定的每液體體積葉輪功率輸入(P/V)是攪拌和通氣容器最常用的規(guī)模放大標(biāo)準(zhǔn)之一，其中來自葉輪的機(jī)械功率會影響氣體傳輸特性和培養(yǎng)混合。P/V比可以通過調(diào)整葉輪類型、尺寸和速度來適應(yīng)不同的工作體積。如表7所示，此放大標(biāo)準(zhǔn)可以單獨使用，也可以與其它因素（例如每單位體積液體的恒定體積氣體流量或vvm）結(jié)合使用。恒定P/V已用于成功地從Ambr?250小型生物反應(yīng)器系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到200L中試規(guī)模的一次性生物反應(yīng)器，以證明基于空氣噴射的pH控制策略的有效性。在比較500L中試規(guī)模與3L臺式生物反應(yīng)器、或從Ambr?250放大到3L臺式然后50L中試規(guī)模容器時，應(yīng)用相同的標(biāo)準(zhǔn)會產(chǎn)生可比的增長、生產(chǎn)力和產(chǎn)品質(zhì)量屬性。恒定P/V也被證明是成功的規(guī)?？s小標(biāo)準(zhǔn)，以在Ambr?250中匹配18,000L工業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器的條件和性能。在200L和2,000L規(guī)模下，使用恒定P/V的細(xì)胞培養(yǎng)性能也有可比性，盡管在較大的生物反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)pCO2水平更高。然而，使用恒定的P/V可能會轉(zhuǎn)化為小規(guī)模和大規(guī)模kLa值之間的顯著差異。為了補(bǔ)償單位體積氧傳質(zhì)系數(shù)的變化，可能需要調(diào)整通氣策略，以維持所需的溶氧水平。當(dāng)使用微型生物反應(yīng)器完成上游工藝開發(fā)步驟時尤其如此。然而，所需的流速調(diào)整可能會對培養(yǎng)性能產(chǎn)生不利影響，例如Tescione等人的研究。當(dāng)使用P/V作為唯一標(biāo)準(zhǔn)從2,000L工業(yè)規(guī)模容器縮小到3L實驗室規(guī)模生物反應(yīng)器時，觀察到活細(xì)胞密度和最終產(chǎn)品滴度顯著降低。在小型生物反應(yīng)器中，標(biāo)準(zhǔn)化氣體體積流量(vvm)高出三倍，導(dǎo)致氣泡相關(guān)的細(xì)胞損傷增加。通過轉(zhuǎn)錄組分析比較和評估了使用恒定葉輪葉尖速度或恒定P/V從微型(Ambr?15)到10L生物反應(yīng)器的規(guī)模放大，以評估對基因表達(dá)的影響。對于所使用的兩種放大標(biāo)準(zhǔn)，獲得了可比較的細(xì)胞生長和特異性生產(chǎn)率，但與10L生物反應(yīng)器相比，Ambr?15中觀察到整個培養(yǎng)過程中的pCO2水平降低，這是因為微型生物反應(yīng)器中需要更大的氧氣流速，導(dǎo)致CO2汽提增加。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，隨著時間的推移，兩種規(guī)模之間基因表達(dá)的差異很?。ǖ陀?%）。盡管2455和1601個基因分別在Ambr?15和10L生物反應(yīng)器中受到獨特調(diào)控，但規(guī)?；蚣?xì)胞行為沒有進(jìn)行功能關(guān)聯(lián)。1恒定氧傳質(zhì)系數(shù)(KLa)在CHO細(xì)胞培養(yǎng)中，保持適當(dāng)?shù)难鯕鈧鬏斨陵P(guān)重要，尤其是當(dāng)生物反應(yīng)器在高細(xì)胞密度下運(yùn)行時。因此，在規(guī)模放大/縮小期間保持恒定kLa也是工藝開發(fā)中的常用策略。在將Ambr?250用作5L實驗室規(guī)模和250LSUB系統(tǒng)的規(guī)?？s小模型時，其已被成功地用作標(biāo)準(zhǔn)。2-3h-1的kLa滿足規(guī)?？s小模型中的氧氣需求，并導(dǎo)致13種GS-CHO和DG44-CHO細(xì)胞系中的11種具有可比的生長、生產(chǎn)力和最終產(chǎn)物滴度。通過氣體流速和攪拌速度調(diào)整保持恒定的kLa(7.9h-1)也被證明可以在50L到2,000L的一次性生物反應(yīng)器中產(chǎn)生類似的生長曲線。然而，生產(chǎn)規(guī)模的變化可能需要使用不同類型的氣體鼓泡，從而使類似工藝條件的實現(xiàn)更加復(fù)雜。為了從配備鉆孔鼓泡的2,000L容器縮小到使用恒定kLa的3L生物反應(yīng)器，Tescione等人不得不采用小規(guī)模的熔塊鼓泡，以避免混合速度過快或氣體流速過高，這已被證明對培養(yǎng)性能有害。但與大規(guī)模工藝相比，改變鼓泡類型會導(dǎo)致不同的細(xì)胞生長和代謝。為了獲得適當(dāng)?shù)难鯕鈧鬏?，He等人開發(fā)了一個數(shù)學(xué)傳質(zhì)模型來描述生物反應(yīng)器內(nèi)的氣體交換。涉及細(xì)胞呼吸速率(qO2,qCO2)和傳質(zhì)特性(kLaO2,kLaCO2)的質(zhì)量平衡方程用于計算滿足氧氣需求和預(yù)測pCO2水平所需的氣體流速。這種放大方法導(dǎo)致在2L和1,500L條件下獲得了相當(dāng)?shù)幕罴?xì)胞密度和抗體產(chǎn)量。類似地，通過假設(shè)與在2,000L生物反應(yīng)器中測量的結(jié)果相同的需氧量，來確定3L縮小模型中所需的kLa和富氧水平。這允許設(shè)置適當(dāng)?shù)耐饴?，從而產(chǎn)生可比的細(xì)胞培養(yǎng)性能，而不影響蛋白質(zhì)質(zhì)量。2每體積的恒定體積氣體流速(vvm)溶解的CO2積累是生物反應(yīng)器中CHO細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模放大過程中的一個主要問題，恒定的vvm通常用作放大標(biāo)準(zhǔn)，以確保充分的CO2汽提，同時調(diào)整攪拌速度，以提供適當(dāng)?shù)难鹾稀Ｎ⑿蜕锓磻?yīng)器Ambr?15用于開發(fā)工業(yè)和臺式生物反應(yīng)器的規(guī)?？s小模型，使用總噴射氣體流速作為主要規(guī)?？s小參數(shù)（vvm為0.01-0.02）。這種規(guī)?？s小的方法允許進(jìn)行充分的汽提，并使CO2釋放曲線在不同規(guī)模上保持恒定。由DoE確定的最佳操作條件（生長溫度、生產(chǎn)溫度和pH值）表明對于Ambr?15和5L生物反應(yīng)器是一致的。另一項研究嘗試使用恒定vvm，針對500L和2,000LSUB，使用Ambr?250平臺生成具有代表性的規(guī)?？s小模型。但由于表面氣體轉(zhuǎn)移通常占小規(guī)模CO2汽提的很大一部分，因此在小型生物反應(yīng)器系統(tǒng)中需要較低的歸一化通氣率來匹配不同規(guī)模之間的pCO2氣體釋放曲線。在pCO2已被確定為對培養(yǎng)性能有重大影響的不同過程中，恒定vvm被用作標(biāo)準(zhǔn)，以匹配工業(yè)規(guī)模工藝和Ambr?250系統(tǒng)之間的溶解氣體分布。這種方法導(dǎo)致了不同規(guī)模之間可比的活細(xì)胞密度和產(chǎn)品滴度，說明需根據(jù)工藝的具體要求選擇放大程序。恒定最小通氣vvm和等效P/V已被組合用作規(guī)模放大標(biāo)準(zhǔn)，以確保細(xì)胞生長、氣體傳輸和mAb生產(chǎn)率在3L、500L和2,000LSUB的各種規(guī)模上均匹配。選擇最小空氣流速以實現(xiàn)適當(dāng)?shù)腃O2汽提。在另一項研究中，使用恒定P/V和vvm作為使用Ambr?250創(chuàng)建規(guī)?？s小模型的標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)致DO水平較低(<5%)，并且無法模擬大規(guī)模的性能。這歸因于小規(guī)模的較低氣體停留時間和隨之而來的氧氣傳遞系數(shù)的降低。在生物反應(yīng)器放大過程中要考慮的另一個重要因素是氣體入口速度的影響。這在工業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器中尤其值得關(guān)注，其需要更高的氣體流速來供應(yīng)氧氣并確保適當(dāng)?shù)腃O2汽提。高氣體入口速度(>60m/s)被認(rèn)為對培養(yǎng)性能有害，因為在鼓泡區(qū)域中湍流能量轉(zhuǎn)移急劇增加。此外，高噴射率已被證明會引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且還與氨基酸消耗的增加有關(guān)，以恢復(fù)氧化還原平衡。入口速度小于20m/s，在某些情況下高達(dá)50m/s，在小型到大型生物反應(yīng)器中不會造成明顯的細(xì)胞損傷。Part5、恒定葉輪葉尖速度

保持等效的葉輪葉尖速度可被用作規(guī)模放大標(biāo)準(zhǔn)，以便在不同的生產(chǎn)規(guī)模下保持相當(dāng)?shù)淖畲蠹羟袘?yīng)力水平。例如，當(dāng)使用0.7