加德納菌感染對大鼠睪丸生精小管的影響_第1頁
加德納菌感染對大鼠睪丸生精小管的影響_第2頁
加德納菌感染對大鼠睪丸生精小管的影響_第3頁
加德納菌感染對大鼠睪丸生精小管的影響_第4頁
全文預(yù)覽已結(jié)束

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

加德納菌感染對大鼠睪丸生精小管的影響

加德納感染(gv)是女性細菌陰道感染的主要病原體之一,可以通過性接觸傳播。近年來,國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),不明原因的男性不育患者精液中Gv的檢出率明顯高于正常男性,提示Gv感染與不育可能有密切關(guān)系,張水林等報道Gv感染在男性不育的發(fā)生、精子質(zhì)量的改變中可能起一定的作用。但Gv感染引起不育的病理機制尚未闡明。睪丸生精細胞凋亡是生精過程中發(fā)生的一種正常生理現(xiàn)象,這對于清除受損生精細胞、控制其數(shù)量具有重要意義。生精細胞大量凋亡,則會導(dǎo)致生精障礙。電鏡是觀察細胞凋亡最可靠的方法,凋亡細胞在透射電鏡下其形態(tài)學改變具有特征性。現(xiàn)已證明,支原體感染的SD雄性大鼠睪丸嚴重損傷,并引發(fā)不育,而Gv感染常常伴隨支原體感染。本實驗建立Gv感染的動物模型,采用HE染色光鏡結(jié)合電鏡觀察,檢測模型動物睪丸生精小管的變化,采用流式細胞術(shù)檢測生精細胞凋亡情況,旨在為闡明Gv感染影響精子生成,導(dǎo)致不育的致病機制提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1大鼠中科院動物所選用體重180~220g,出生60~70d的清潔級,雄性SD大鼠(中科院動物所)18只,隨機分為對照組6只和實驗組12只。1.2實驗大鼠睪丸脫服務(wù)在傳統(tǒng)知識體系中的表達無菌實驗條件下,戊巴比妥鈉(35mg/mL,1.8mL/kg)腹腔注射,麻醉動物后,打開腹腔,充分暴露膀胱,將膀胱內(nèi)尿液抽出,采用1mL注射器,實驗組膀胱內(nèi)注射1mLGv菌液(上海同濟醫(yī)院葉元康老師贈送,梅里埃比濁管測定,108/mL),對照組膀胱內(nèi)注射相應(yīng)的無菌液體培養(yǎng)基1mL,每只注射一次,手術(shù)完畢縫合關(guān)腹,并且在同一無菌條件下飼養(yǎng)21d后頸椎脫臼處死大鼠。1.3細菌培養(yǎng)和鑒定隨機取每鼠的部分睪丸組織,接種于Gv選擇性培養(yǎng)基上,置于5%CO2、37℃孵育箱孵育24~48h,觀察菌落周圍溶血環(huán),刮取細菌,馬尿酸試驗鑒定細菌,涂片革蘭染色,油鏡下查找Gv,電鏡下觀察細菌形態(tài),以鑒定模型是否成功建立。1.4多聚賴氨酸載玻片的制備迅速摘取睪丸,取每只鼠的部分睪丸組織立即置于Bouin′s液中固定,12h后系列酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚5μm,貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上,54℃烤干2h備用。1.5生精細胞的觀察將待用的組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟,系列酒精下行入水,蘇木精染細胞核,鹽酸酒精分色后,用伊紅染細胞質(zhì),蒸餾水短洗后,經(jīng)系列酒精脫水,二甲苯透明、封片,光鏡(NikonE600,日本)下觀察生精上皮的細胞層次、形態(tài)結(jié)構(gòu)、脫落及凋亡的生精細胞。1.6結(jié)構(gòu)觀察和電鏡觀察取部分睪丸組織立即置于2%戊二醛固定,環(huán)氧樹脂Epon812包埋,超薄切片(厚度100nm),電鏡(Phllip-CM120TEM,荷蘭)觀察。1.7細胞凋亡檢測單細胞懸液制備按文獻方法略加修改,取部分睪丸組織,剪碎,120目網(wǎng)孔輕壓過濾,離心。0.25%胰蛋白酶消化,37℃水浴4min,300目網(wǎng)孔過濾PBS洗,300×g離心5min,70%酒精固定過夜,離心去酒精,加入2mLPBS放置10min,離心,取(1~2)×106個細胞加入RNA酶,然后再加入PI(25μg/mL,Sigma,美國)染液,常溫下染色15min,上機檢測(FACsCealibur,美國BD公司),對細胞群用熒光通道2(FL2W/FL2A)寬度和面積進行開商,去除細胞碎片團塊,對完整的細胞進行分析,正常細胞周期峰前面出現(xiàn)的亞峰即為凋亡峰(apoptosispeak),另取部分睪丸組織,制備成單細胞懸液,用Annexin-Ⅴ與PI染色,上機檢測凋亡細胞百分率。2結(jié)果2.1睪丸生精細胞排列能力的測定睪丸組織經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后,對照組均未見菌落出現(xiàn),馬尿酸實驗無色,呈陰性。實驗組動物12只中11只有菌落出現(xiàn),菌落周圍出現(xiàn)β-溶血環(huán),馬尿酸實驗紫色,呈陽性,光鏡下細菌呈革蘭陰性鏈狀短桿菌,電鏡下細菌呈鏈狀連接,電子密度不等(圖1~3)。由此說明實驗組動物12只中,11只建模成功,成功率達91.7%。光鏡下顯示,對照組睪丸生精小管規(guī)則,界膜完整,各級生精細胞排列有序(圖4A)。實驗組凋亡生精細胞明顯多于對照組,可見大量不同時期凋亡形態(tài)的生精細胞,細胞皺縮、胞膜完整,染色質(zhì)邊聚,呈新月狀或沙丘狀,高倍鏡下典型凋亡形態(tài)細胞的核膜較清晰(圖4B、C),部分生精小管凋亡嚴重,呈廣泛的生精小管退行性變化,包括生精小管萎縮和生精細胞嚴重脫落,有的生精小管僅剩下少量精原細胞和支持細胞,部分生精小管支持細胞也明顯減少,生精小管中出現(xiàn)大量的多核巨細胞,位置靠近生精小管的管腔,細胞體巨大,可有數(shù)個至數(shù)十個核,核密度不均勻,部分高度濃縮,呈致密核(圖4D)。2.3精細胞凋亡和變性收縮對照組大鼠睪丸生精細胞及支持細胞染色質(zhì)均勻,核膜完整平滑,細胞器結(jié)構(gòu)正常(圖5A、B)。實驗組大鼠睪丸生精細胞出現(xiàn)大量不同時期凋亡現(xiàn)象,染色質(zhì)濃縮,多數(shù)附于核膜,附著區(qū)核孔消失,部分核發(fā)生碎裂(圖5C);支持細胞變性收縮,細胞間出現(xiàn)大的間隙,細胞膜不規(guī)則,細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡和髓樣結(jié)構(gòu),脂滴明顯增大,細胞核收縮,核膜不規(guī)則(圖5D)。生精小管管腔生精細胞排列紊亂(生精小管底部可見蝌蚪狀精子)(圖5E)。2.4實驗組單倍體峰前出現(xiàn)亞峰經(jīng)檢測,對照組可見3個正常峰,峰1為單倍體峰,峰2為二倍體細胞峰,峰3為四倍體細胞峰。各峰前未出現(xiàn)AP峰(圖6A),實驗組單倍體峰前出現(xiàn)亞峰,即AP峰(圖6B)。采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對各組的凋亡細胞(含各級精母細胞、支持細胞等)百分率進行t檢驗統(tǒng)計分析,對照組與實驗組凋亡細胞百分率分別為(9.59±2.2)%,(23.23±7.4)%,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.13,P<0.05)。3gv感染導(dǎo)致睪丸生精細胞凋亡近年來,有關(guān)Gv引起男性不育的報道逐漸增多,男性不育往往是由多種不同因素造成的一個共同的病理結(jié)果,因而探討男性不育的發(fā)病機制一直是男性生殖病理研究的重點內(nèi)容。細胞凋亡是多細胞有機體為了調(diào)控機體發(fā)育,維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細胞主動死亡過程。人體在正常生精過程中也存在著少量生精細胞凋亡,這對睪丸的許多正常生理功能具有重要的意義。有研究表明,在生理情況下,睪丸生殖細胞中的細胞凋亡主要見于精原細胞和精母細胞,很少發(fā)生在精子細胞中。但若生精細胞的凋亡超過了正常范圍,可能導(dǎo)致不育。本研究通過建立Gv感染的SD大鼠模型,觀察到Gv感染后生精細胞發(fā)生凋亡、脫落,支持細胞變性,出現(xiàn)大量多核巨細胞,經(jīng)過流式細胞術(shù)檢測,單倍體細胞峰前出現(xiàn)凋亡峰,證實了Gv感染導(dǎo)致超過生理數(shù)量的生精細胞凋亡,從而影響精子的發(fā)生。Gv感染引起不育的可能原因有:(1)Gv產(chǎn)生的外毒素直接作用于各級生精細胞導(dǎo)致細胞出現(xiàn)大量凋亡、脫落,影響精子的形成,使成熟精子數(shù)量減少;若損傷嚴重,則可表現(xiàn)為少精癥或無精子癥,從而導(dǎo)致生殖能力下降,以致不育。(2)Gv產(chǎn)生的外毒素導(dǎo)致支持細胞變性,胞質(zhì)塌陷,從而破壞了支持細胞對生精細胞的支持、營養(yǎng)功能,致使生精細胞向管腔面的移動及釋放精子的功能異常,從而使生精細胞排列紊亂,并使鑲嵌其上的生精細胞因無所附著而致

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論