加德納菌感染對大鼠睪丸生精小管的影響

加德納菌感染對大鼠睪丸生精小管的影響

加德納感染（gv）是女性細菌陰道感染的主要病原體之一，可以通過性接觸傳播。近年來,國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),不明原因的男性不育患者精液中Gv的檢出率明顯高于正常男性,提示Gv感染與不育可能有密切關(guān)系,張水林等報道Gv感染在男性不育的發(fā)生、精子質(zhì)量的改變中可能起一定的作用。但Gv感染引起不育的病理機制尚未闡明。睪丸生精細胞凋亡是生精過程中發(fā)生的一種正常生理現(xiàn)象,這對于清除受損生精細胞、控制其數(shù)量具有重要意義。生精細胞大量凋亡,則會導(dǎo)致生精障礙。電鏡是觀察細胞凋亡最可靠的方法,凋亡細胞在透射電鏡下其形態(tài)學改變具有特征性。現(xiàn)已證明,支原體感染的SD雄性大鼠睪丸嚴重損傷,并引發(fā)不育,而Gv感染常常伴隨支原體感染。本實驗建立Gv感染的動物模型,采用HE染色光鏡結(jié)合電鏡觀察,檢測模型動物睪丸生精小管的變化,采用流式細胞術(shù)檢測生精細胞凋亡情況,旨在為闡明Gv感染影響精子生成,導(dǎo)致不育的致病機制提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1大鼠中科院動物所選用體重180~220g,出生60~70d的清潔級,雄性SD大鼠(中科院動物所)18只,隨機分為對照組6只和實驗組12只。1.2實驗大鼠睪丸脫服務(wù)在傳統(tǒng)知識體系中的表達無菌實驗條件下,戊巴比妥鈉(35mg/mL,1.8mL/kg)腹腔注射,麻醉動物后,打開腹腔,充分暴露膀胱,將膀胱內(nèi)尿液抽出,采用1mL注射器,實驗組膀胱內(nèi)注射1mLGv菌液(上海同濟醫(yī)院葉元康老師贈送,梅里埃比濁管測定,108/mL),對照組膀胱內(nèi)注射相應(yīng)的無菌液體培養(yǎng)基1mL,每只注射一次,手術(shù)完畢縫合關(guān)腹,并且在同一無菌條件下飼養(yǎng)21d后頸椎脫臼處死大鼠。1.3細菌培養(yǎng)和鑒定隨機取每鼠的部分睪丸組織,接種于Gv選擇性培養(yǎng)基上,置于5%CO2、37℃孵育箱孵育24~48h,觀察菌落周圍溶血環(huán),刮取細菌,馬尿酸試驗鑒定細菌,涂片革蘭染色,油鏡下查找Gv,電鏡下觀察細菌形態(tài),以鑒定模型是否成功建立。1.4多聚賴氨酸載玻片的制備迅速摘取睪丸,取每只鼠的部分睪丸組織立即置于Bouin′s液中固定,12h后系列酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚5μm,貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上,54℃烤干2h備用。1.5生精細胞的觀察將待用的組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟,系列酒精下行入水,蘇木精染細胞核,鹽酸酒精分色后,用伊紅染細胞質(zhì),蒸餾水短洗后,經(jīng)系列酒精脫水,二甲苯透明、封片,光鏡(NikonE600,日本)下觀察生精上皮的細胞層次、形態(tài)結(jié)構(gòu)、脫落及凋亡的生精細胞。1.6結(jié)構(gòu)觀察和電鏡觀察取部分睪丸組織立即置于2%戊二醛固定,環(huán)氧樹脂Epon812包埋,超薄切片(厚度100nm),電鏡(Phllip-CM120TEM,荷蘭)觀察。1.7細胞凋亡檢測單細胞懸液制備按文獻方法略加修改,取部分睪丸組織,剪碎,120目網(wǎng)孔輕壓過濾,離心。0.25%胰蛋白酶消化,37℃水浴4min,300目網(wǎng)孔過濾PBS洗,300×g離心5min,70%酒精固定過夜,離心去酒精,加入2mLPBS放置10min,離心,取(1~2)×106個細胞加入RNA酶,然后再加入PI(25μg/mL,Sigma,美國)染液,常溫下染色15min,上機檢測(FACsCealibur,美國BD公司),對細胞群用熒光通道2(FL2W/FL2A)寬度和面積進行開商,去除細胞碎片團塊,對完整的細胞進行分析,正常細胞周期峰前面出現(xiàn)的亞峰即為凋亡峰(apoptosispeak),另取部分睪丸組織,制備成單細胞懸液,用Annexin-Ⅴ與PI染色,上機檢測凋亡細胞百分率。2結(jié)果2.1睪丸生精細胞排列能力的測定睪丸組織經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后,對照組均未見菌落出現(xiàn),馬尿酸實驗無色,呈陰性。實驗組動物12只中11只有菌落出現(xiàn),菌落周圍出現(xiàn)β-溶血環(huán),馬尿酸實驗紫色,呈陽性,光鏡下細菌呈革蘭陰性鏈狀短桿菌,電鏡下細菌呈鏈狀連接,電子密度不等(圖1~3)。由此說明實驗組動物12只中,11只建模成功,成功率達91.7%。光鏡下顯示,對照組睪丸生精小管規(guī)則,界膜完整,各級生精細胞排列有序(圖4A)。實驗組凋亡生精細胞明顯多于對照組,可見大量不同時期凋亡形態(tài)的生精細胞,細胞皺縮、胞膜完整,染色質(zhì)邊聚,呈新月狀或沙丘狀,高倍鏡下典型凋亡形態(tài)細胞的核膜較清晰(圖4B、C),部分生精小管凋亡嚴重,呈廣泛的生精小管退行性變化,包括生精小管萎縮和生精細胞嚴重脫落,有的生精小管僅剩下少量精原細胞和支持細胞,部分生精小管支持細胞也明顯減少,生精小管中出現(xiàn)大量的多核巨細胞,位置靠近生精小管的管腔,細胞體巨大,可有數(shù)個至數(shù)十個核,核密度不均勻,部分高度濃縮,呈致密核(圖4D)。2.3精細胞凋亡和變性收縮對照組大鼠睪丸生精細胞及支持細胞染色質(zhì)均勻,核膜完整平滑,細胞器結(jié)構(gòu)正常(圖5A、B)。實驗組大鼠睪丸生精細胞出現(xiàn)大量不同時期凋亡現(xiàn)象,染色質(zhì)濃縮,多數(shù)附于核膜,附著區(qū)核孔消失,部分核發(fā)生碎裂(圖5C);支持細胞變性收縮,細胞間出現(xiàn)大的間隙,細胞膜不規(guī)則,細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡和髓樣結(jié)構(gòu),脂滴明顯增大,細胞核收縮,核膜不規(guī)則(圖5D)。生精小管管腔生精細胞排列紊亂(生精小管底部可見蝌蚪狀精子)(圖5E)。2.4實驗組單倍體峰前出現(xiàn)亞峰經(jīng)檢測,對照組可見3個正常峰,峰1為單倍體峰,峰2為二倍體細胞峰,峰3為四倍體細胞峰。各峰前未出現(xiàn)AP峰(圖6A),實驗組單倍體峰前出現(xiàn)亞峰,即AP峰(圖6B)。采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對各組的凋亡細胞(含各級精母細胞、支持細胞等)百分率進行t檢驗統(tǒng)計分析,對照組與實驗組凋亡細胞百分率分別為(9.59±2.2)%,(23.23±7.4)%,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.13,P<0.05)。3gv感染導(dǎo)致睪丸生精細胞凋亡近年來,有關(guān)Gv引起男性不育的報道逐漸增多,男性不育往往是由多種不同因素造成的一個共同的病理結(jié)果,因而探討男性不育的發(fā)病機制一直是男性生殖病理研究的重點內(nèi)容。細胞凋亡是多細胞有機體為了調(diào)控機體發(fā)育,維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細胞主動死亡過程。人體在正常生精過程中也存在著少量生精細胞凋亡,這對睪丸的許多正常生理功能具有重要的意義。有研究表明,在生理情況下,睪丸生殖細胞中的細胞凋亡主要見于精原細胞和精母細胞,很少發(fā)生在精子細胞中。但若生精細胞的凋亡超過了正常范圍,可能導(dǎo)致不育。本研究通過建立Gv感染的SD大鼠模型,觀察到Gv感染后生精細胞發(fā)生凋亡、脫落,支持細胞變性,出現(xiàn)大量多核巨細胞,經(jīng)過流式細胞術(shù)檢測,單倍體細胞峰前出現(xiàn)凋亡峰,證實了Gv感染導(dǎo)致超過生理數(shù)量的生精細胞凋亡,從而影響精子的發(fā)生。Gv感染引起不育的可能原因有:(1)Gv產(chǎn)生的外毒素直接作用于各級生精細胞導(dǎo)致細胞出現(xiàn)大量凋亡、脫落,影響精子的形成,使成熟精子數(shù)量減少;若損傷嚴重,則可表現(xiàn)為少精癥或無精子癥,從而導(dǎo)致生殖能力下降,以致不育。(2)Gv產(chǎn)生的外毒素導(dǎo)致支持細胞變性,胞質(zhì)塌陷,從而破壞了支持細胞對生精細胞的支持、營養(yǎng)功能,致使生精細胞向管腔面的移動及釋放精子的功能異常,從而使生精細胞排列紊亂,并使鑲嵌其上的生精細胞因無所附著而致