番茄紅素對小鼠抗氧化酶體系的影響

番茄紅素對小鼠抗氧化酶體系的影響

許多研究結(jié)果表明，類黃酮具有抗逆性和自由基藍(lán)色胺的生物學(xué)效果。但是番茄紅素的體內(nèi)吸收和生物利用上存在一些不明確的問題。對人體而言，很多因素影響番茄紅素的吸收。有人將番茄紅素吸收可分為4步：食物基質(zhì)的消化、形成固定的磷脂微團(tuán)、被小腸粘膜細(xì)胞攝取以及經(jīng)淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)。每一步脂肪都是必需的。因此，食物基質(zhì)的組成、顆粒大小、加工處理和人體脂肪代謝狀況等因素都可能會影響到番茄紅素的吸收。吸收后進(jìn)入體內(nèi)的番茄紅素所顯示的淬滅氧自由基和上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶類活性效應(yīng)成為番茄紅素生物學(xué)效應(yīng)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。在生物體內(nèi)由于番茄紅素的生物學(xué)性質(zhì)，伴隨著消除氧自由基的發(fā)生，產(chǎn)生著一系列生理生化反應(yīng)過程，了解和研究這些過程機(jī)理有助于促進(jìn)番茄紅素在預(yù)防疾病應(yīng)用方面的深入研究。本研究進(jìn)行番茄紅素的不同溶劑液灌胃小鼠實(shí)驗(yàn)，比較小鼠血液番茄紅素的含量濃度和體內(nèi)抗氧化效果，探討提高番茄紅素的生物學(xué)效應(yīng)和生物利用度的機(jī)理過程。1材料和方法1.1材料表面番茄市售；菜子油市售。1.2試劑丙酮、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、氫氧化鈉、鹽酸、石油醚。1.3灌液和水乳濁液的制備提取工藝流程如下所示：番茄→搗碎成泥→有機(jī)溶劑浸提→提取液—番茄紅素。石油醚與丙酮以1:2的比例混合作為提取液，浸提6h，再將混合物過濾，蒸餾干燥，除去有機(jī)溶液，制得番茄紅素粗提粉狀物。按照3mg/ml濃度調(diào)制制成水乳濁液和油溶液的灌胃液。番茄紅素溶液在475nm比色計(jì)算含量。1.4灌喂劑對血液番茄紅素的影響選用18只購自安徽醫(yī)科大學(xué)純種雌性健康小鼠，隨機(jī)分為3組，每組6只，實(shí)驗(yàn)灌胃不同溶劑的番茄紅素灌喂劑后的血液番茄紅素濃度；54只同樣小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，測定油溶番茄紅素灌喂劑后的血漿SOD、CAT和POD酶活性；18只同樣小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，測定油溶番茄紅素灌喂劑后的血漿MDA含量。1.5番茄紅素吸收與氧化試驗(yàn)1.5.1灌胃量及離心管的制備小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為空白對照組，水溶番茄紅素組，油溶番茄紅素組，空白組喂食普通飼料，番茄紅素灌胃量按照30mg/kg·bw，胃底灌胃，連續(xù)4d，每天兩次。第4d停止喂食空腹過夜后，次日早晨小鼠眼球取血，置于預(yù)先用肝素鈉1×10-6U/L的溶液處理過的離心管。迅速放入高速離心機(jī)中，5000r/min離心5min后用微量進(jìn)樣器小心吸取上清液，用石油醚:丙酮=1:2的混合液定量浸提上清液，在475nm比色。1.5.2小鼠肝臟相關(guān)酶活性的測定取3組小鼠，分別為即空白對照組，水溶番茄紅素組和油溶番茄紅素組，喂食方法同上，連續(xù)4d，每天兩次。第4d停止喂食空腹過夜后，取小鼠肝臟制酶液。酶液制備：取肝臟，加9倍肝臟質(zhì)量的預(yù)冷PBS溶液，冰水浴中勻漿，15000r/min，離心15min(離心時溫度維持在4℃)，上清液即為酶的提取液，置冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.3酶活性的測定1.5.3.試劑及其制備考馬斯亮藍(lán)法(G-250)測定蛋白質(zhì)濃度。Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天試劑公司)，包括：G250染色液(4℃保存)、蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)5mg/ml(-20℃保存)、PBS已配準(zhǔn)備稀釋用。按試劑盒說明，酶標(biāo)儀在578nm的波長下測定(318MC型酶標(biāo)儀上海三科公司)，比色法分別檢測肝臟酶液樣蛋白量。1.5.3.酶活性的測定3ml反應(yīng)液中，磷酸緩沖液(pH7.0)的濃度為50mmol/L、甲硫氨酸的濃度為13mmol/L、氮藍(lán)四唑(NBT)的濃度為75mmol/L、EDTA的濃度為0.1mmol/L、核黃素的濃度為4μmol/L，酶液200μl搖勻后快速置于光照培養(yǎng)箱進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，結(jié)束時立即置于黑暗處終止反應(yīng)，并在560nm下比色，1個酶活性單位相當(dāng)于引起3ml反應(yīng)液達(dá)到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%抑制所需要的酶量，全值的測定方法，3ml反應(yīng)液置室溫下讓酶充分失活，然后比色所測值即為全值，以A560nm變化百分率表示酶的活性。1.5.3.中心五軸化反應(yīng)3ml反應(yīng)液中，磷酸緩沖液(pH7.0)的濃度為50mmol/L、H2O2的濃度為8mmol/L、酶液200μl,30℃下反應(yīng)1min，立即加入2ml體積分?jǐn)?shù)為10%的H2SO4終止反應(yīng)，然后用2mmol/LKMnO4溶液滴定剩余H2O2，根據(jù)H2O2的消耗量計(jì)算CAT活性。1.5.3.酶活性s13ml反應(yīng)液中，磷酸緩沖液(pH7.0)濃度為100mmol/L，愈創(chuàng)木酚濃度為30mmol/L,H2O2濃度為26mmol/L，酶液200μl。在470下比色，持續(xù)50min，記錄初值和每反應(yīng)1min時的比色值，以A470nm表示酶的活性。上述三種酶活性是分別在灌喂水混合番茄紅素和油混合番茄紅素后的肝臟酶活性表示，如果需要相對比較，則用肝臟樣液蛋白量的相對酶比活力，即每毫克蛋白量中酶的活性。1.5.3.tba用量測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituricacidreactivesubstance,TBARS)測定方法，上述反應(yīng)終止后每支試管各加入0.7%的TBA水溶液3ml，沸水浴中加熱1h，冰浴冷卻后，535nm波長比色。2結(jié)果與分析2.1c組小鼠血漿中番茄紅素的檢測番茄紅素的浸提可用氯仿、乙醚、石油醚、正己烷、丙酮、乙醇以及四氫呋喃等有機(jī)溶劑。通過幾種有機(jī)試劑浸提比色分析對比，浸提效果比較好的溶劑為乙醚、丙酮、氯仿、石油醚等，但是從實(shí)際應(yīng)用推廣價值分析，采用石油醚與丙酮1:2體積混合的浸提以及吸光度比色分析效果為好，可以較好地消除β-胡蘿卜素吸光峰的干擾和影響。小鼠血漿經(jīng)離心分離，上清液用石油醚與丙酮混合液浸提后的紫外可見光分光光度計(jì)(UV757CRT)掃描圖譜(圖1)，在475～500nm獲得吸收峰及空白血清定量添加番茄紅素的回歸曲線(圖2)，并用此法檢測血液中番茄紅素含量。不同小鼠個體間產(chǎn)生的番茄紅素吸收差異較為明顯；油溶和水溶的番茄紅素灌胃劑產(chǎn)生的血液中含量差異達(dá)到極顯著水平(見表1)。2.2酶活力的測定小鼠肝臟的SOD和POD活性以測定吸光度變化率表示酶的活性，CAT則以H2O2的消耗量表示其酶活性，MDA以吸光度的變化率表示其相對含量變化；用肝臟勻漿酶測試的樣液進(jìn)行蛋白量測定，可以獲得酶的相對比活力，用以SOD、POD和CAT酶活的相對比較。根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(0.5mg/ml)配制成0.0025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5等蛋白含量濃度(mg/ml)，分別在酶標(biāo)儀(578nm)上測定吸光度，得回歸曲線為Y=0.9867X+0.0132(R=0.9989)，水溶和油溶番茄紅素飼喂的兩組小鼠肝臟勻漿酶液各取三份，分別測定吸光度，并根據(jù)回歸曲線方程計(jì)算蛋白量(表2)。2.3不同次次酶活中肝臟細(xì)胞內(nèi)源性氧化酶活性的檢測在肝臟中抗氧化酶主要是谷胱甘肽過氧化酶(含硒和不含硒谷胱甘肽過氧化酶，簡稱SeGPx和nonSeGPx)、CAT、SOD、POD等。H2O2是肝臟細(xì)胞中主要的內(nèi)源性過氧化物，其含量與內(nèi)源性氧化酶體系活性有密切關(guān)系。因此實(shí)驗(yàn)選擇SOD、POD和CAT為番茄紅素的影響對象進(jìn)行檢測試驗(yàn)對比。小鼠肝臟經(jīng)高速離心分離后的上清液，分別按照上述酶活測定方法進(jìn)行，每份樣液用量為200μl，檢測與計(jì)算結(jié)果見表3。通常情況下，各種酶活的變化趨勢與比活基本相似，因此以(檢測值-CK)÷(檢測值×樣液蛋白量×檢測樣品用量)關(guān)系計(jì)算出相對酶比活，用以比較酶活變化動態(tài)。2.4常生長發(fā)育狀態(tài)下抗氧化酶系統(tǒng)的變化從實(shí)驗(yàn)小鼠購入至灌胃宰殺前給與正常喂食，體重變化為購入時20.25±1.03g，宰殺前27.23±1.04g，屬于生長發(fā)育狀況正常。在正常生長發(fā)育狀態(tài)下的體內(nèi)抗氧化酶活性以及受番茄紅素的影響變化，則可以認(rèn)為主要是食物代謝和體內(nèi)正常生理活動所產(chǎn)生。如表3所示，與空白對照相比，SOD、POD及CAT的活性在水溶和油溶的飼喂后都有提高，但以油溶番茄紅素飼喂后抗氧化酶活性提高顯著，而伴隨的結(jié)果是體內(nèi)生物氧化產(chǎn)物丙二醛含量隨之降低(表3)，脂質(zhì)過氧化作為發(fā)病機(jī)制的研究越來越受到人們的重視。因此，血清MDA是一項(xiàng)有臨床意義的生物標(biāo)志物。3番茄紅素提高生物利用度本實(shí)驗(yàn)旨在探討番茄紅素在動物體內(nèi)消化吸收以及對體內(nèi)吸收后的抗氧化效果，也就是番茄紅素的生物學(xué)效應(yīng)(bioefficacy)和生物利用度(bioavailability)。番茄紅素與含氧類胡蘿卜素、羥基類胡蘿卜素構(gòu)成類胡蘿卜素的三大類組成，小腸對類胡蘿卜素的吸收率很低，約占膳食量的10%～30%，隨著膳食中類胡蘿卜素的增加和脂肪減少，其吸收率下降。表1所示結(jié)果顯示，膳食條件對番茄紅素的吸收影響較大，油脂有助于番茄紅素的吸收。但是過分依賴于油溶或借助于脂肪代謝而提高番茄紅素的吸收，可能會產(chǎn)生膳食均衡的問題。如何在滿足膳食均衡前提下提高番茄紅素的生物利用度，這為進(jìn)一步探討番茄紅素的微膠囊、納米載體核心等材料的應(yīng)用提出了思路空間。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示番茄紅素對體內(nèi)SOD、POD和CAT活性都有促進(jìn)作用，尤其是POD的活性促進(jìn)。李秋霞等對力竭性運(yùn)動后小鼠肝臟檢測，發(fā)現(xiàn)力竭性運(yùn)動后肝臟的POD活性升高，但CAT活性與SOD活性則無顯著性變化；付妍等利用旋轉(zhuǎn)磁場對小鼠肝組織過氧化物酶活性影響的試驗(yàn)結(jié)果顯示，對POD的促進(jìn)活性效果也是遠(yuǎn)高于促進(jìn)SOD的效果。這說明動物的正常生理活動、體內(nèi)外的理化環(huán)境，包括膳食和藥物都有可能影響體