太湖不同營養(yǎng)水平湖心區(qū)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究

太湖不同營養(yǎng)水平湖心區(qū)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究

1浮游動物對微生物的作用湖泊富營養(yǎng)化已成為世界范圍內(nèi)的一個突出環(huán)境問題。這導(dǎo)致的水質(zhì)和水環(huán)境惡化的嚴(yán)重后果引起人們的關(guān)注，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚（azberietal.，2000）。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，微生物是最敏感、易受環(huán)境影響的生物群體。它們不僅是水生生態(tài)系統(tǒng)生物量的重要組成部分，也是物質(zhì)循環(huán)和養(yǎng)分交換的重要組成部分。微生物不僅可以將有機(jī)碳（poc）分解，還可以將溶解有機(jī)碳（doc）轉(zhuǎn)化為連續(xù)的浮游植物。浮游生物通過添加沉積物和自己的組件進(jìn)入上層，以控制水生生態(tài)系統(tǒng)的基本功能。然而，通過分離和培養(yǎng)方法，我們只能獲得不到1%的環(huán)境微生物（azametal.，1995）。大量環(huán)境微生物在傳統(tǒng)的分離和繁殖過程中被破壞，對環(huán)境中微生物的真實(shí)存在認(rèn)識喪失。利用微生物生態(tài)學(xué)研究可以顯著提高人類對實(shí)際環(huán)境中微生物多樣性的認(rèn)識（pace，1997）。越來越多的研究人員開始關(guān)注水生生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境因素與微生物群落變化之間的聯(lián)系關(guān)系（meetal.1999；lentier，2001；yannarel，2004）。太湖是一個典型的水平湖。經(jīng)過長期的歷史發(fā)展，不同類型的湖泊形成了生態(tài)效應(yīng)強(qiáng)的湖泊，如草類、藻類、貧化和極端豐富的營養(yǎng)化。這為研究水生微生物對污染負(fù)荷提供了理想的場所。在這項(xiàng)工作中，我們使用了16-srdna-dgge和fdc方法來研究不同類型湖泊中浮游生物的群落變化，并將改性梯度凝膠和細(xì)菌燈直接計(jì)數(shù)與不同類型湖泊的橫向變化相結(jié)合。更全面地反映了微生物多樣性和生物量的動態(tài)變化，以發(fā)現(xiàn)水體富營養(yǎng)化過程對水生微生物群的影響。2材料和方法表面活性劑2.1水湖泊水質(zhì)狀況太湖(30°56′～31°34′N,119°554′～120°36′E)面積2338km2,最大水深2.6m,平均水深1.9m,是一典型的淺水湖泊(秦伯強(qiáng)等,2004).運(yùn)用GPS定位系統(tǒng)在不同湖區(qū)布設(shè)8個采樣點(diǎn),1#、2#點(diǎn)位于五里湖區(qū),該區(qū)緊靠無錫市,水體處于超富營養(yǎng)化狀態(tài);3#、4#點(diǎn)處于梅梁灣中,該湖灣自20世紀(jì)90年代起,每年的5到10月份均有藍(lán)藻出現(xiàn),水體富營養(yǎng)化嚴(yán)重;湖心的5#、6#點(diǎn)由于遠(yuǎn)離岸邊,受外界干擾較小,水體的營養(yǎng)水平相對較低;7#、8#點(diǎn)所在貢湖灣是水草豐富區(qū),分布有大量馬來眼子菜及少量微齒眼子菜等沉水植物.具體點(diǎn)位見圖1.2.2水樣的預(yù)處理和分析水樣的采集于2005年2月進(jìn)行,采集水深0.5m左右處水樣.微生物樣品的采集:用于表面熒光記數(shù)的水樣注入經(jīng)酸浸泡、清洗干凈、預(yù)先滅菌的玻璃瓶中,加入無顆粒甲醛(甲醛終濃度2%),帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存直至分析;用于基因組DNA提取的水樣,放入帶有冰塊的保溫箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后-20℃保存至分析;其它水樣用預(yù)先洗干凈的塑料瓶采集,放入帶有冰塊的保溫箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即測定.2.3樣品分析2.3.1浮物優(yōu)度染色采用表面熒光直接計(jì)數(shù)的方法,用核酸染料DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)染色,于熒光顯微鏡(ZeissMicroscope,100WHBOMercurylightsource)在放大倍數(shù)為16×100倍數(shù)下觀察記數(shù),然后將視野細(xì)菌數(shù)量轉(zhuǎn)換為每毫升實(shí)際細(xì)菌細(xì)胞數(shù)(cells·mL-1),即為浮游細(xì)菌豐度.2.3.2聚碳酸酯鹽懸液的制備在無菌條件下取500mL水樣用定性濾紙(8μm,47mm,Millipore)過濾,除去樣品中的懸浮顆粒,收集濾液,濾液通過聚碳酸酯膜(0.22μm,47mm,Millipore)真空抽濾,然后用無菌緩沖液沖洗兩次.將濾膜取出剪成碎片裝入1.5mL的離心管中-80℃保存.2.3.3dna提取純度的測定將離心管在室溫下解凍,在其中加入30μL新鮮的溶菌酶溶液,37℃溫育1h(160r·min-1)后,加入500μLSDS(10%)溶液和10μL蛋白酶K(20mg·mL-1),接著溫育2h.隨后加入200μL的5mol·L-1NaCl上下顛倒混勻后在其中加入預(yù)熱到65℃的100μLCTAB溶液,并在65℃下溫育50min.初提的DNA中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)上下顛倒、混勻、離心(12000g,10min),取上清加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)上下顛倒、混勻、離心(12000g,30min),取上清加入0.6倍體積的異丙醇常溫沉淀1h,離心(16000g,20min)后去上清液,將DNA溶于30μL無菌水,加入1.5μLRNaseA(20mg·mL-1)37℃消化20min.DNA提取液的測定,使用酶標(biāo)儀(T)對提取的DNA粗提液樣品進(jìn)行測定(OD260/OD280),計(jì)算所得樣品DNA產(chǎn)量和純度.2.4擴(kuò)增產(chǎn)物的pcr擴(kuò)增使用16SrDNAV3區(qū)通用引物F341(5’CCTACGGGAGGCAGCAG3’)和R518(5’ATTACCGCGGCTGCTGG3’)從水樣基因組總DNA中擴(kuò)增16SrDNAV3區(qū)基因片段,PCR擴(kuò)增體系和程序參考文獻(xiàn)于熱循環(huán)儀上進(jìn)行反應(yīng)(PTC-200MJResearch公司).為使擴(kuò)增產(chǎn)物能在DGGE上更好的分離,一個40bp的GC夾子(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)加在F3415’端.PCR反應(yīng)體系:10×PCRbuffer(含25mmol·L-1MgCl2)5μL,引物F341GC和R518各15pmol,dNTPs12.5pmol,約25ng的基因組DNA,Taq酶5μL,加milli-Q水至50μL.采用降落PCR方法,反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性4min;94℃變性1min,65℃退火1min,然后以每一循環(huán)降低1℃進(jìn)行10個循環(huán),72℃延伸1min,最后,以55℃退火進(jìn)行23個循環(huán);72℃延伸10min.2.5聚丙烯酰胺微生物的擴(kuò)增基因組總DNA16SrDNAV3區(qū)擴(kuò)增片段通過DGGE(C.B.S★SCIENTIFIC公司)分離來研究微生物群落多樣性.聚丙烯酰胺的變性梯度范圍為35%～55%,DNA擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量約為200ng,150V,1×TAE緩沖液中電泳600min.電泳完畢后用SYBRgreenI(1×TAE,1∶10000)染色30min,通過UVI成像系統(tǒng)來成像.2.6紫外分光光度法溫度現(xiàn)場用水溫計(jì)直接測定;總氮、總磷用紫外分光光度計(jì)測定;葉綠素a用90%丙酮萃取熒光分光光度法測定,DOC用美國生產(chǎn)的1020A型TOC儀測定.2.7處理數(shù)據(jù)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在SPSSforwindows(11.5)統(tǒng)計(jì)軟件上進(jìn)行處理.3結(jié)果結(jié)果3.1水溫變化不大,樣品點(diǎn)水溫隨時(shí)間的變化各采樣點(diǎn)的水深在整個太湖中變化不甚明顯,最淺處水深2.30m,最深2.85m,總體上變化不大.不同湖區(qū)各采樣點(diǎn)水溫基本上變化不大,維持在4.5℃左右,但是存在從河口到大太湖略微下降的趨勢,這可能與五里湖和梅梁灣緊靠無錫市有關(guān).水體中營養(yǎng)物質(zhì)氮、磷含量在不同湖區(qū)中存在明顯差異,五里湖和梅梁灣明顯高于湖心和貢湖灣,有機(jī)碳和葉綠素的含量也存在類似變化趨勢.3.2浮物群落數(shù)量的比較表面熒光直接計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,水體中浮游細(xì)菌數(shù)量在不同營養(yǎng)水平湖區(qū)中具有明顯水平分布特征(見圖2).在營養(yǎng)水平較高的五里湖和藍(lán)藻頻繁出現(xiàn)的梅梁灣水體中浮游細(xì)菌數(shù)量顯著高于大太湖和貢湖灣(p<0.05),其中位于營養(yǎng)水平較高的2#、4#采樣點(diǎn)細(xì)菌數(shù)量分別達(dá)5.33×106cells·mL-1和5.92×106cells·mL-1,相比之下湖心區(qū)細(xì)菌數(shù)量明顯較少,6#點(diǎn)最低,為2.68×106cells·mL-1.但是,富營養(yǎng)化程度較高的五里湖和梅梁灣及營養(yǎng)水平較低的湖心和貢湖灣中浮游細(xì)菌的數(shù)量差異并不顯著(p>0.05).總體上,水體中細(xì)菌數(shù)量在太湖各個不同營養(yǎng)水平湖區(qū)中存在較大差異.3.3srdna片段pcr和測序?yàn)楸苊馑w中雜質(zhì)的干擾(小型原生動物,藻類及樣品中的腐殖質(zhì)等雜質(zhì)),實(shí)驗(yàn)采用了不同孔徑濾膜過濾富積水體中細(xì)菌生物量.利用凍融和化學(xué)裂解相結(jié)合的方法提取水體中微生物的基因組DNA.通過-80℃的超低溫冷凍和溫浴,以及溶菌酶和表面活性劑等手段盡可能使全部菌體破壁,使DNA最大限度地釋放出來,保證獲得全部細(xì)菌基因組DNA,并增加DNA的提取效率.提取的DNA通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn),樣品總基因組片段均在23kb左右,DNA測定結(jié)果OD260/OD280在0.16～0.21范圍內(nèi),達(dá)到PCR擴(kuò)增所需要求.將提取出的DNA進(jìn)行16SrDNA片段的PCR擴(kuò)增.采用降落PCR擴(kuò)增方法,提高了樣品的擴(kuò)增特異性,降低了DGGE分析的誤差.經(jīng)PCR反應(yīng)后獲得了各采樣點(diǎn)微生物的16SrDNA基因V3區(qū)的目的片斷,用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn),擴(kuò)增出的DNA片段大小為230bp左右(堿基對),證實(shí)為16SrDNAV3區(qū)特異性片段.各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物可用于DGGE分析.3.4凝膠電泳dage指紋圖譜的建立變性梯度凝膠電泳(DGGE)變性梯度凝膠電泳可對具有相同大小分子量而不同DNA序列的片斷進(jìn)行分離,由此推斷不同環(huán)境樣品PCR產(chǎn)物中含有不同序列的DNA片斷,它們是一些特異微生物種類的16SrDNA基因V3區(qū)的DNA片斷,每個獨(dú)立分離的DNA片斷理論上可以代表一種微生物.各采樣點(diǎn)水樣中細(xì)菌DGGE圖譜如圖3所示,不同生態(tài)類型湖區(qū)樣品經(jīng)過變性梯度凝膠電泳(DGGE)都可以分離出數(shù)目不等的電泳條帶,且各個條帶的信號強(qiáng)度和遷移位置不同.電泳條帶的多少基本上代表生物多樣性,條帶越亮,表示該種屬微生物的數(shù)量越大,從而確定不同水樣中所含有的微生物的種類和數(shù)量關(guān)系,得出其中微生物多樣性的信息.從圖3中可看出,各泳道都含有數(shù)目及遷移率各異的條帶,lane1、2(代表貢湖灣水草區(qū))條帶數(shù)目較多,隨著水體污染程度的加重,條帶數(shù)量呈逐步降低的趨勢,從水草豐富的貢湖灣湖區(qū)到超富營養(yǎng)的五里湖,細(xì)菌DGGE條帶數(shù)量從33條降低到22條.從條帶遷移率及灰度來看,各水樣泳道間條帶變化幅度較大.在五里湖的1#、2#采樣點(diǎn),微生物的DGGE指紋圖譜表現(xiàn)為條帶數(shù)目總量少優(yōu)勢條帶明顯的特點(diǎn),隨著水環(huán)境條件的改變和水體營養(yǎng)水平的下降,微生物的DGGE指紋圖譜表現(xiàn)出優(yōu)勢條帶的數(shù)目較少而總體條帶數(shù)目明顯增多的特征,在沉水植物區(qū)(貢湖灣)微生物群落表現(xiàn)出較高的相似性.從圖3可看出,沉水植物區(qū)水體細(xì)菌的DGGE指紋圖譜表現(xiàn)出明顯增加的變化特征.4討論4.1不同類型水體中細(xì)菌數(shù)量的變化從對不同湖區(qū)中細(xì)菌數(shù)量的結(jié)果來看,在太湖不同類型湖區(qū)水域中細(xì)菌的數(shù)量存在明顯不同,從超富營養(yǎng)的五里湖(梅梁灣)到貧營養(yǎng)狀態(tài)的湖心區(qū),細(xì)菌數(shù)量呈顯著下降趨勢.在近岸的五里湖和梅梁灣水域中,外源輸入的營養(yǎng)物質(zhì),加上大量藻類分泌物及藻類殘?bào)w,這些易被微生物吸收的溶解性有機(jī)物,可能為細(xì)菌的生長提供了豐富的餌料(Bainesetal.,1991),從而促進(jìn)了水體中細(xì)菌數(shù)量的大量生長(見圖2),同時(shí),浮游植物的大量生長,為水體中的浮游動物提供了充足的餌料,降低了浮游動物對細(xì)菌的捕食壓力;在湖心水體中,由于遠(yuǎn)離沿岸帶,受排污染影響較小,富營養(yǎng)化程度相對較低,浮游和底棲動物數(shù)量較多(李文朝,1996),而浮游藻類的數(shù)量下降(見表1),營養(yǎng)物質(zhì)減少和原生動物捕食的雙重壓力使水體中微生物的數(shù)量減少;貢湖灣水生植被豐富區(qū),植物的生長轉(zhuǎn)移了水體及底泥中的營養(yǎng)物質(zhì),使水體中營養(yǎng)鹽發(fā)生了轉(zhuǎn)移,水體有機(jī)質(zhì)的形態(tài)也因此發(fā)生了改變,水體中營養(yǎng)物質(zhì)含量的降低,限制了水體中細(xì)菌的過量生長.結(jié)合本文所測得的水質(zhì)參數(shù),參照太湖富營養(yǎng)化程度評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(孫順才等,1993)的相關(guān)指標(biāo),對太湖水體中細(xì)菌數(shù)量與富營養(yǎng)水平進(jìn)行相關(guān)分析表明,太湖中細(xì)菌數(shù)量隨水體富營養(yǎng)水平升高而增加(r=0.88)(見圖4).對不同類型水體的研究表明,在營養(yǎng)水平較低的湖泊中,無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)含量的大小可能是微生物生長的限制因子(Chrzanowskietal.,1995).而磷含量的高低常常成為水體中細(xì)菌數(shù)量的限制因素(Morrisetal.,1992;Toolanetal.,1991;Wangetal.,1992),在一定條件下,氮含量的多少也可能影響到微生物數(shù)量的變化(Markusetal.,1992),然而,在自然環(huán)境中,溶解性有機(jī)質(zhì)的變化常常左右因氮磷比改變而引起的微生物數(shù)量的變化(Schweitzeretal.,1995).就太湖而言,尤其是靠近無錫市的五里湖和藻類長期出現(xiàn)梅梁灣這樣的富營養(yǎng)湖區(qū),加上從周圍不斷排入的營養(yǎng)物質(zhì),N、P已不是微生物生長的限制因子(馮勝等,2006).水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致了浮游植物的生產(chǎn)力和生物量的提高,進(jìn)而改變了浮游生物和底棲生物的群落結(jié)構(gòu)(Smetaceketal.,1991).改變了傳統(tǒng)食物連和微食物環(huán)的能量負(fù)荷,引起了高營養(yǎng)級生物資源的變化.4.2水體細(xì)菌群落多樣性的變化運(yùn)用16SrDNA-DGGE指紋分析方法對復(fù)雜環(huán)境的微生物種群有明顯優(yōu)勢(Amannetal.,1995),但影響其分辨率的因素也很多,DGGE方法并不能對樣品中所有的DNA片段進(jìn)行分離(Vallaeysetal.,1997),只能對微生物群落中數(shù)量上大于1%的優(yōu)勢種群進(jìn)行分析(Muyzeretal.,1993).而且這些方法可能在PCR過程中受變性時(shí)間的長短,雙鏈鉸鏈現(xiàn)象及退火溫度不同等因素的影響而產(chǎn)生偏差(Ferrisetal.,1997),盡管存在這樣那樣的不足,但是到目前為止,用PCR-DGGE技術(shù)來研究不同環(huán)境中微生物群落變化,還是一種比較理想的工具(Muyzeretal.,1998).從本研究的細(xì)菌DGGE指紋圖譜上可以看出,在太湖這種典型的富營養(yǎng)淺水湖泊中,由于水環(huán)境條件的改變及營養(yǎng)水平的差異,不同湖區(qū)水體中微生物的種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化,2000年曾經(jīng)實(shí)施過底泥疏浚的五里湖和藍(lán)藻頻繁爆發(fā)的梅梁灣中水體細(xì)菌的多樣性明顯較低,而在沉水植物繁茂的貢湖灣里,水體細(xì)菌的多樣性則相對較多,研究表明,在極度貧營養(yǎng)條件下,水體中微生物種類相對較少,隨著營養(yǎng)水平的逐漸升高,微生物由于營養(yǎng)物質(zhì)等生存條件的改變,多樣性會增加(Chrzanowskietal.,1995).對太湖的研究表明,超富營養(yǎng)和接近超富營養(yǎng)湖區(qū)的水體中細(xì)菌群落多樣性表現(xiàn)為減少的趨勢.在梅梁灣中,尤其是秋冬季節(jié)由于微囊藻的分解水體中藻毒素的含量是顯著增加的(許秋瑾等,2005),而五里湖幾年前也是藍(lán)藻高發(fā)區(qū).這可能對某些微生物產(chǎn)生了毒害或抑制作用,限制了清水型微生物的生長繁殖,而一些生態(tài)幅較寬的耐污種則可利用浮游植物產(chǎn)生(分泌物或殘?bào)w)的大量有機(jī)物而過量繁殖,因而產(chǎn)生了明顯的特征條帶(見圖5);在貢湖灣中由于水生植物的生長,一方面降低了水體中營養(yǎng)鹽的濃度(黃蕾等,2005),而且某些水生植物還可抑制水體中浮游植物(如微囊藻)的生長(Jones,1990),從而減少了水體中藻毒素的含量(Mitrovicetal.,2005;Yinetal.,2005),同時(shí),沉水植物的生長又可吸收轉(zhuǎn)化水體中一些有毒有害物質(zhì),給更多類型微生物的生長繁殖提供了優(yōu)良場,從而增加了水體中細(xì)菌的群落多樣性.對湖泊中微生物群落變化的研究已有很多(Lindstr?m,2000;Vanderetal.,2001;Yannarelletal.,2004),而且,越來越多的研究開始關(guān)注引起這種變化的原因(Vanderetal.,2001;Yannarelletal.,2004).對Wisconsin(Yannarelletal.,2004)13個湖泊中