熱蒸加工方式對大菱scophbusmaximus過敏反應的影響

熱蒸加工方式對大菱scophbusmaximus過敏反應的影響

1產品加工后運用免疫原性的變化情況結果表明，食物過敏在加工過程中會發(fā)生一些變化，如變形、聚合和化學修養(yǎng)，這些變化可能會影響你的過敏反應能力，并顯示與血清特定ige結合能力的變化[1.3]。這些變化多種多樣,比如經(jīng)焙烤或油炸的花生過敏原其IgE結合能力顯著增強而高壓加熱卻可以降低花生過敏原的免疫原性。隨著人們對過敏原認識的深入,在日常生活中盡可能避免攝入過敏原從而減輕過敏疾病的危害成為大家的共識,這要求有準確可靠的檢測方法,但目前的檢測方法基本上是針對未加工的食品。由于加工過程中過敏原的變化導致假陽性和假陰性的檢測結果時常出現(xiàn),因此有必要對加工后過敏原免疫原性的變化情況進行研究,為進一步開發(fā)準確可靠的過敏原檢測方法提供基礎數(shù)據(jù)。食品加工的方式主要分為熱蒸加工和非熱蒸加工兩類,在我們日常生活中,熱蒸加工是最常見的加工手段,是我國傳統(tǒng)的食品加工方式,其產品具有營養(yǎng)損失少,口感好等特點。因此,本研究以我國養(yǎng)殖量大、營養(yǎng)豐富的高端水產品——大菱鲆為研究對象研究熱蒸加工方式對其過敏原免疫原性的影響,一方面明確熱蒸對大菱鲆過敏原免疫原性的影響,為開發(fā)低過敏性的水產食品提供技術支持,另一方面探討熱蒸后的大菱鲆過敏原與IgE結合能力的變化,為提高魚類過敏原檢測方法的準確性和可靠性提供技術支持。2儀器和試劑2.1儀器、檢測儀器HPScanjetG4050型平板掃描儀(美國惠普公司)電泳儀DYY-7C(北京市六一儀器廠);酶標儀(RS-232C,ThermoLabsystems);冷凍離心機(BR4i,法國Jouan);恒溫孵育箱(WGP-350,上海安亭科技儀器廠);冷凍干燥機(FD1,Heto);DYCZ-40A半干轉印儀(北京六一儀器廠);TU1810型紫外可見分光光度計(北京普析儀器有限公司);Tanon180凝膠成像系統(tǒng)(上海天能有限公司)。2.2試劑及試劑廠大菱鲆(活品,購于青島利群超市);0.45μmPVDF膜(Millipore公司);陽性血清取自青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院,分裝存于-80℃超低溫冰箱;HRP-羊抗人IgE(KPL公司);丙酮(煙臺市雙雙化工有限公司);DTT(二硫蘇糖醇)(Solarbit);Tris堿(青島福林生物化學有限公司);吐溫-20(天津市大茂化學試劑廠);SDS(十二烷基磺酸鈉,山東愛博科技貿易有限公司);雙丙烯酰胺(濟南愛博經(jīng)貿有限公司);過硫酸銨(濟南愛博經(jīng)貿有限公司);2-巰基乙醇(上海凌峰化學試劑有限公司);四甲基二乙胺(TEMED)(AMRESCO);PierceECL蛋白印跡底物(ThermoScientific),以上試劑如果沒有特別說明,均為分析純級試劑。2.3實驗方法2.3.1加適量的容器將大菱鲆進行“三去”處理后,取背部肌肉6份,每份約50g,將其中一份冷藏備用,其他5份分別放入清潔干燥的容器中。向蒸鍋中加入適量的水,在電磁爐中加熱至沸騰。將魚肉放在帶孔的隔板上,同時放入蒸鍋中,分別在5min、10min、15min、20min、30min后,取出魚肉,并迅速冷卻至室溫,放在4℃冰箱中備用。2.3.2蛋白質組分分析將處理后的5組樣品和未處理的樣品分別稱重,按1∶2(w∶v)的比例加入Tris-Gly(pH8.3)+0.05%的DTT抽提液,2000r/min組織搗碎機勻漿后,于4℃條件下振蕩抽提12h,9000r/min離心15min,收集上清液,過濾除去懸浮于溶液上層的油脂,4℃保存。所得沉淀重復抽提5h后,采用同樣的方法處理,將上清液與第一批上清液合并,于4℃條件下在雙蒸水中透析24h,采用Bradford法測定蛋白質濃度,分裝保存于-40℃冰箱中備用。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS–PAGE)法對處理后的大菱鲆進行蛋白質組分分析,濃縮膠濃度為5%(w∶v),分離膠濃度為15%(w∶v),蛋白樣品濃度為1mg/mL,加樣品緩沖液后沸水浴5min。電泳結束后取下凝膠用考馬斯亮藍R–250染色,脫色后采用凝膠成像儀采集圖像,并進行分析。2.3.3蛋白條帶轉移的檢測參照張軼群等的方法并略有改進,處理后的大菱鲆樣品過SDS后,采用半干轉印儀,恒流30mA轉印3h,將凝膠上的蛋白條帶轉移到PVDF膜上。轉移完畢后,用麗春紅S對PVDF膜進行染色,檢測蛋白條帶是否轉移成功,采用PBST脫色。將膜浸泡在封閉液(5%牛血清白蛋白/PBST)中2h,然后用PBST洗滌3次,每次5min,下面的洗滌方法相同。一抗采用過敏患者血清特異性IgE(1∶10)/兔源小清蛋白抗體(1∶10000),室溫下過夜孵育后洗滌,二抗采用HRP標記的羊抗人IgE(1∶2000)/HRP標記的羊抗兔IgG(1∶2000),37℃孵育1h后,洗滌,然后將PVDF膜浸沒在ECL蛋印跡底物中孵育1min,在凝膠成像儀中曝光成像,并采用凝膠分析軟件對IgE/IgG結合能力進行分析。2.3.4ph值的兔抗小清蛋白藥物免疫參考李小燕的方法并略作改進,用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(CBS,pH9.6)將樣品稀釋至10μg/mL,100μL/孔于4℃過夜,用含0.1%Tween-20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3次,每次5min,將孔內剩余液體拍干,下面的洗滌方法相同,加入含1%BSA的PBST,300μL/孔,37℃封閉1.5h,洗滌,加入用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4,稀釋液)稀釋20000倍的兔抗小清蛋白多克隆抗體,100μL/孔,37℃孵育1.5h,洗滌,再加入HRP-羊抗兔IgG(1∶5000),100μL/孔,37℃孵育1h,洗滌。加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液,100μL/孔,37℃避光顯色20min后,加入2mol/LH2SO4(50μL/孔)終止反應,用酶標儀測定450nm處的吸光值OD450,分析熱蒸處理對大菱鲆過敏原免疫原性的影響。3結果3.1具有較強的熱穩(wěn)定性采用SDS對5組經(jīng)過不同熱蒸處理時間的大菱鲆蛋白組分進行分析,以未經(jīng)熱蒸加工的大菱鲆蛋白組分作對照。結果如圖1所示,在未經(jīng)過熱蒸加工的魚肉蛋白提取液中,蛋白組分較多;經(jīng)過熱蒸加工后魚肉中蛋白組分明顯減少,33~41kDa、48~57kDa蛋白大部分缺失。37kDa、24kDa蛋白以及10~12kDa的小清蛋白有很強的耐熱性,其中,分子量為11kDa的小清蛋白比12kDa的小清蛋白更加耐熱。這與Hansen等的研究結果一致,>40kDa的魚肉蛋白具有熱不穩(wěn)定性,而低分子量的蛋白具有極好地熱穩(wěn)定性。此外,24kDa、37kDa蛋白極可能是小清蛋白的二聚體、三聚體,由此可見小清蛋白及其多聚體熱穩(wěn)定性極強。從圖1中還可看出,經(jīng)過熱蒸加工后的大菱鲆魚肉蛋白組分中,在17~18kDa左右出現(xiàn)了兩條新的蛋白條帶,熱蒸處理5min時,魚肉蛋白組分基本重新穩(wěn)定,隨著熱蒸處理時間地延長,蛋白組分及各組分含量并沒有明顯的變化。3.2不同熱蒸加工對1da蛋白的免疫活性選用魚類過敏患者的血清,采用免疫印跡法對未經(jīng)過熱蒸加工的魚肉蛋白及經(jīng)過不同時長熱蒸加工的魚肉蛋白各組分免疫活性進行對比分析,結果如圖2所示?？梢钥闯?未經(jīng)過熱蒸加工的大菱鲆蛋白組分中陽性反應較強烈的蛋白為60kDa、50kDa及35kDa左右,而在加熱后,由于分子量>35kDa的蛋白均有不同程度的缺失,在免疫印跡反應中也未出現(xiàn)這一分子量范圍的陽性蛋白條帶;35kDa蛋白雖然有很好的耐熱性,在熱蒸加工后依然存在,但已喪失了免疫活性;樣品A對20kDa蛋白反應較強,且該蛋白的免疫活性隨著熱蒸處理時間的增加并未有明顯變化,免疫活性基本穩(wěn)定;除35kDa蛋白外,與樣品B有陽性反應的蛋白條帶在熱蒸加工后后含量減少,甚至缺失,導致熱蒸加工后的魚肉與之無陽性反應;樣品C對未經(jīng)處理的20kDa蛋白沒有陽性反應,但與熱蒸加工后的該蛋白條帶產生了結合,此外還與熱蒸加工后新產生的18kDa蛋白以及分子量11~12kDa的小清蛋白陽性反應較強,經(jīng)過熱蒸加工后小清蛋白的免疫活性并未受到影響,Hansen等人的研究也證實小清蛋白經(jīng)過4h的水煮處理依然保持其免疫活性;樣品D對于未經(jīng)處理的魚肉60kDa、40kDa及35kDa蛋白反應強烈,而經(jīng)過熱蒸處理后陽性反應也消失。經(jīng)過熱蒸加工后,魚肉中大部分致敏蛋白的免疫活性隨著蛋白條帶的缺失而喪失,分子量35kDa蛋白雖然有很好的熱穩(wěn)定性,但其過敏原性卻被熱蒸加工過程所破壞;分子量為20kDa的蛋白經(jīng)過熱蒸加工后免疫活性并未降低,甚至有所增加;熱蒸加工后在18kDa左右出現(xiàn)一條新的蛋白條帶,且該條帶存在免疫活性,而它在未經(jīng)過熱蒸加工的魚肉樣品中是缺失的,這表明經(jīng)過熱蒸加工后,魚肉蛋白中產生了新的致敏蛋白。3.3熱蒸加工對金槍魚凝膠的活性利用兔抗小清蛋白多克隆抗體,通過免疫印跡法對未經(jīng)過熱蒸加工的魚肉及經(jīng)過不同時長熱蒸加工的魚肉蛋白各組分免疫活性進行對比分析,結果如圖3所示?？梢钥闯?熱蒸加工前后,魚肉中主要過敏原為分子量11~12kDa的小清蛋白、分子量為24kDa、35kDa及50kDa的蛋白。與圖1的電泳結果進行對比,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過熱蒸加工,分子量為50kDa的蛋白在SDS分析中基本不可見,而在免疫印跡實驗結果中,該蛋白條帶的過敏原性并沒有消失,說明其抗體結合位點熱穩(wěn)定性強,并未隨著蛋白變性甚至降解而失去活性。這些陽性蛋白條帶無論從分子量還是從耐熱性來看,都極有可能是小清蛋白的二聚體、三聚體以及四聚體,還有待進一步分析。3.4在熱蒸過程中不同保鮮劑制備魚采用間接酶聯(lián)免疫法對熱蒸加工后的大菱鲆過敏原的免疫原性進行分析,結果如圖4所示。圖4結果表明,5組經(jīng)過不同熱蒸處理時間的大菱鲆過敏原的免疫原性有了大幅降低。蒸5min時大菱鲆過敏原免疫原性降低了67.9%;蒸10min時魚肉過敏原免疫原性降低了72.5%;經(jīng)過熱蒸處理15min后,魚肉過敏原免疫原性降低了77.6%;蒸20min后,魚肉過敏原免疫原性降低了74.6%;經(jīng)過30min的熱蒸加工后,魚肉過敏原免疫原性降低了89.2%。這說明隨著熱蒸處理時間的增加,大菱鲆過敏原的免疫原性呈遞減趨勢,但在最初的5min內下降幅度最大,熱蒸處理5min至20min時大菱鲆過敏原免疫原性下降幅度不明顯,而經(jīng)過熱蒸處理30min后,大菱鲆過敏原免疫原性又有較大的降幅。4在熱蒸加工后對魚類的免疫活性和致病力的影響目前很多研究都表明通過加工可以降低食物過敏原的免疫原性。加熱后魚肉蛋白的變化是十分復雜的,Hansen等人研究表明經(jīng)過水煮處理的魚肉過敏原免疫活性顯著降低,而Bernhisel等研究發(fā)現(xiàn)魚肉罐頭與水煮處理的魚肉相比過敏原性又有更大程度地降低,雙盲對照實驗中有新鮮魚肉過敏患者對魚肉罐頭反應呈陰性。此外,Helbling等的研究顯示,6名鱈魚過敏患者中有2人對鱈魚魚糜SPT試驗結果為陽性。而由本實驗結果可以知道,經(jīng)過熱蒸加工后的大菱鲆魚肉蛋白組分中,在17~18kDa左右出現(xiàn)了兩條新的蛋白條帶,而且熱蒸加工后新出現(xiàn)的18kDa左右蛋白條帶存在免疫活性,它在未經(jīng)過熱蒸加工的魚肉樣品中是缺失的,這表明經(jīng)過熱蒸加工后,魚肉蛋白中產生了新的致敏蛋白,新條帶的來源以及這個新IgE結合條帶的過敏特性還需要進一步研究確定。經(jīng)熱蒸加工后魚肉中的蛋白質條帶數(shù)目有很大地減少,但對于一些熱穩(wěn)定性良好的蛋白,其過敏原性所受的影響較低;經(jīng)熱蒸加工的大菱鲆過敏原與兔源小清蛋白抗體有一定的結合能力,其中分子量為50kDa的蛋白很可能是小清蛋白的二聚體、三聚體以及四聚體,但其聚合的機制以及其抗體結合位點熱穩(wěn)定性的變化情況尚且未知,需要繼續(xù)深入地對大菱鲆等魚類過敏原及表位進行研究。熱蒸加工可使魚肉過敏原蛋白的免