利用雙對(duì)數(shù)制作酶動(dòng)力學(xué)米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率

利用雙對(duì)數(shù)制作酶動(dòng)力學(xué)米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率

在酶動(dòng)力學(xué)中，隨著溫度、phh和酶濃度的穩(wěn)定，物壤濃度對(duì)酶的促進(jìn)反應(yīng)速度有顯著影響。在底物濃度很低時(shí),酶促反應(yīng)的速度隨底物濃度的增加而迅速增加;隨著底物濃度的繼續(xù)增加,反應(yīng)速度的增加開(kāi)始減慢;當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程度時(shí),反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值Vmax。Vmax是酶的一個(gè)基本特征常數(shù),它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。從酶動(dòng)力學(xué)米氏方程式可知,米氏常數(shù)Km等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度,米氏常數(shù)的單位就是濃度單位,mol/L。Km與底物濃度、酶濃度無(wú)關(guān),與pH、溫度、離子強(qiáng)度等因素有關(guān)。對(duì)于每一個(gè)酶促反應(yīng),在一定條件下都有其特定的值,因此可用于鑒別酶。1雙固相轉(zhuǎn)移的雙培養(yǎng)方程法目前測(cè)定Km和Vmax,一般仍用作圖法。作圖法有很多種,最常用的是雙倒數(shù)方程作圖法,又稱雙倒數(shù)作圖法,該法是根據(jù)米氏方程的倒數(shù)形式,以1/ν對(duì)1/[S]作圖,可得到一條直線,如圖1所示。其中直線在橫軸上的截距為-1/Km,縱截距為1/Vmax,據(jù)此可求Km和Vmax。雙倒數(shù)方程的表達(dá)式如式(1)所示。其中,ν為反應(yīng)速度,Km為米氏常數(shù),Vmax為酶反應(yīng)最大速度,[S]為底物濃度。2算法求解步驟酶動(dòng)力學(xué)分析模塊(EnzymeKineticsModule)是基于SigmaPlot(著名繪圖軟件)上開(kāi)發(fā)的專業(yè)針對(duì)酶動(dòng)力學(xué)的分析模塊。本文使用的這兩個(gè)軟件版本是EnzymeKineticsModule1.1(SPSS公司產(chǎn)品)和SigmaPlot2000v6.1(Systat公司產(chǎn)品),軟件是從產(chǎn)品公司官網(wǎng)上下載的30天試用版。酶動(dòng)力學(xué)分析模塊聯(lián)合SigmaPlot繪圖軟件求解Km和Vmax步驟如下:1)在操作系統(tǒng)上先安裝SigmaPlot2000后再安裝EKM,安裝最好選擇系統(tǒng)盤(pán)。2)先運(yùn)行SigmaPlot2000再運(yùn)行EKM,出現(xiàn)酶動(dòng)力學(xué)分析數(shù)據(jù)輸入向?qū)?按向?qū)謩?dòng)一步步選擇:底物、底物-抑制劑或底物-激活劑→底物濃度和反應(yīng)速率單位→輸入底物濃度和反應(yīng)速率一組數(shù)值→選擇數(shù)據(jù)處理模型和圖像分析模型→輸出數(shù)據(jù)分析報(bào)告項(xiàng)目選擇→完成(Finish),EKM數(shù)據(jù)輸入向?qū)шP(guān)閉。3)SigmaPlot界面上生成數(shù)據(jù)報(bào)告窗口,界面左欄上選擇點(diǎn)線圖后,彈出制圖向?qū)?手動(dòng)選擇如下:依據(jù)上步選擇的圖像分析模型定制XY軸→完成(Finish);制圖向?qū)шP(guān)閉,生成圖像窗口。注意:XY軸定制完全依據(jù)上步圖像分析模型的選擇情況。舉例說(shuō)明,上步選擇米氏方程后,XY軸的選項(xiàng)中只出現(xiàn)底物濃度和速率選項(xiàng),將濃度分配給X,速率分配給Y;如想將濃度倒數(shù)分配給X,需重新打開(kāi)EKM向?qū)?在圖像分析模型一步中選擇雙倒數(shù)方程等其他方程。4)完成一組數(shù)據(jù)的分析后,若希望下次打開(kāi)后各窗口內(nèi)容完整保存,須將該任務(wù)存檔為.jnb文件。個(gè)人使用經(jīng)驗(yàn):因多數(shù)情況下,僅需要曲線圖,Km、Vmax和數(shù)據(jù)擬合的相關(guān)系數(shù),可以將上述結(jié)果導(dǎo)出到一個(gè).doc文檔內(nèi)。3酶動(dòng)力學(xué)模塊用于解決行程和vmx的問(wèn)題3.1氨氣體積分?jǐn)?shù)與氨氮數(shù)目的核算為了科學(xué)準(zhǔn)確地反映底物濃度、反應(yīng)速率與米氏方程中米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax之間的關(guān)系,選擇了兩套底物濃度范圍:0.02mol/L~0.20mol/L和0.20mol/L~2.00mol/L。氨氣體積分?jǐn)?shù)與氨氮數(shù)目的換算公式如下:1ppt·s-1=10-6ppm·s-1=10-6mL·m-3(大氣)·s-1(2)氨氮數(shù)(NH3-N)=氨(NH3)×14÷17(3)遵循氮(N)物質(zhì)的量守恒原則:脲酶水解反應(yīng)發(fā)生瓶體積2L,氣態(tài)氨密度/大氣密度=0.6,大氣密度=1.293g/L。依據(jù)式(2)和式(3)準(zhǔn)備數(shù)據(jù),處理后的數(shù)據(jù)如表1和表2所示。3.2數(shù)據(jù)輸入和繪制數(shù)據(jù)圖將表1和表2中底物濃度與反應(yīng)速率的數(shù)據(jù)先后分四次在EKM數(shù)據(jù)輸入向?qū)б龑?dǎo)下完成數(shù)據(jù)輸入并自動(dòng)生成數(shù)據(jù)分析報(bào)告,并在SigmaPlot繪圖向?qū)б龑?dǎo)下繪制米氏方程圖,保存數(shù)據(jù)分析報(bào)告和相關(guān)圖像。3.3利用第二組數(shù)據(jù)的方法計(jì)算結(jié)果的報(bào)告如圖2a~圖2d所示。其中,圖2a利用的是表1第一組數(shù)據(jù),圖2b利用的是表1第二組數(shù)據(jù),圖2c利用的是表2第一組數(shù)據(jù),圖2d利用的是表2第二組數(shù)據(jù)。另外,采用雙倒數(shù)作圖法對(duì)表1和表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、繪圖并計(jì)算出Km和Vmax,然后將作圖法和酶動(dòng)力學(xué)模塊法得到的Km和Vmax分別列表對(duì)比,如表3和表4所示。4運(yùn)行ekm軟件后注意量綱的設(shè)置1)向酶動(dòng)力學(xué)分析模塊錄入數(shù)據(jù)前,需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行換算,使用MicrosoftOfficeExcel可批量處理數(shù)據(jù)換算。2)注意量綱的選擇。運(yùn)行EKM軟件后,要先設(shè)置一些常規(guī)項(xiàng),此時(shí)要特別注意量綱的選擇,明確這組需要錄入的數(shù)據(jù)屬于何種酶促反應(yīng)類型,設(shè)置參數(shù)和量綱要特別小心。一旦保存設(shè)置進(jìn)行下一步錄入數(shù)據(jù)后,參數(shù)就不能改變。3)對(duì)比L-B作圖