家畜螨病診斷與防控技術(shù)規(guī)范

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（規(guī)范性）

實(shí)驗(yàn)室檢查顯微鏡檢測(cè)痂皮的采集疥螨病痂皮的采集剪去患部和健康部皮膚交界處的毛后，采用經(jīng)火焰消毒后的小刀垂直于皮膚面用力刮取交界處痂皮，直至刮處皮膚微有出血痕跡，刮破處涂碘伏消毒，將刮取物收集到容器內(nèi)，待檢。癢螨病與足螨病痂皮的采集用鑷子夾取患病部皮膚表面的痂皮或者用消毒小刀用力刮取患病部皮膚表面的痂皮，取痂皮處涂碘伏消毒，將痂皮收集到容器內(nèi)，待檢。鏡檢熱源發(fā)將采集的痂皮放入平皿內(nèi)，將平皿放入25～37℃的恒溫箱中0.5～1h后，將平皿置于顯微鏡下檢查，若檢測(cè)到螨蟲和/或螨卵則判定為陽性。直接圖片檢查法將采集的痂皮放置于載玻片上，滴加1滴5%甘油（丙三醇）水溶液，加蓋載玻片，搓壓玻片至病料散開，分開載片，加蓋片后置顯微鏡下檢查，若檢測(cè)到螨蟲和/或螨卵則判定為陽性。濃集法當(dāng)螨蟲數(shù)量較少時(shí)，可采用濃集法收集螨蟲鏡檢。將刮取的較多痂皮放入10%氫氧化鈉溶液并浸泡過夜或加熱煮5min左右，待其溶液自然沉淀15min，取沉淀物鏡檢?；?qū)⑸鲜龀恋砦镛D(zhuǎn)入試管中，再加入60%硫代硫酸鈉溶液，試管口加蓋玻片，靜置5～10min后，取蓋玻片鏡檢。若鏡檢到螨蟲和/或螨卵則判定為陽性。血清學(xué)檢測(cè)方法采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）檢測(cè)待檢血清樣品中相應(yīng)螨蟲的IgG抗體。操作方法抗原制備疥螨重組烯醇化酶蛋白（rSar-Eno）的制備采用RT-PCR方法從兔源疥螨cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增疥螨Sar-Eno基因，將目的片段連接到pET32a（+）載體，并經(jīng)公司測(cè)序核實(shí)序列正確后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，采用1.0mMIPTG37℃誘導(dǎo)8h后，采用SDS電泳驗(yàn)證表達(dá)情況（rSar-Eno約65kDa）。進(jìn)一步將正確表達(dá)的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，將菌液離心、超聲破碎、鎳柱純化、透析及超濾后，獲得純化后的疥螨重組烯醇化酶蛋白（rSar-Eno），采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，分裝保存于-80℃?zhèn)溆?。綿羊癢螨重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白（rPsoc27）的制備采用RT-PCR方法從綿羊癢螨cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增Psoc27基因，將目的片段連接到pET32a（+）載體，并經(jīng)公司測(cè)序核實(shí)序列正確后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞，采用1.0mMIPTG37℃誘導(dǎo)8h后，采用SDS電泳驗(yàn)證表達(dá)情況（rPsoc27約75kDa）。進(jìn)一步將正確表達(dá)的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，將菌液離心、超聲破碎、鎳柱純化、透析及超濾后，獲得純化后的綿羊癢螨重組絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白（rPsoc27），采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩？乖痪垡蚁┌逵?.1M的碳酸鹽緩沖液（pH9.6）將的抗原稀釋到最佳濃度（rSar-Eno14.5μg/mL，rPsoc2746.0μg/mL）后加入聚乙烯板，每孔100μL，4℃包被過夜。次日，棄孔內(nèi)液體，每孔加入PBST緩沖液（0.01MPBS+0.05%Tween-20，pH7.4）300μL，洗板3次，每次5min，拍干；加封閉液每孔加5%脫脂奶粉（W/V，5g脫脂奶粉+100mLPBS）300μL，37℃封閉1.5h。棄孔內(nèi)液體，洗滌同。加待檢血清每孔加入用PBS緩沖液（0.01MPBS，pH7.4）稀釋的待檢血清100μL（rSar-Eno=1:640；rPsoc27=1:100），每板同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)陽性孔、標(biāo)準(zhǔn)陰性孔以及空白對(duì)照孔，分別加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清以及稀釋液PBS作為對(duì)照。37℃溫育1h后，棄孔內(nèi)血清，洗滌同。加酶標(biāo)二抗用PBS緩沖液（0.01MPBS，pH7.4）將辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗稀釋至工作濃度，加入100μL，37℃溫育1h。棄孔內(nèi)液體，洗滌同。加底物顯色每孔加入底物TMB（3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺）溶液100μL，37℃避光溫育20min。終止反應(yīng)每孔加入2M硫酸（H2SO4）50μL終止反應(yīng)，20min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)XX果。結(jié)果判定以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm的吸光值（OD值），若陽性對(duì)照OD值/陰性對(duì)照OD值的比例大于2.1，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。P為待檢血清孔OD值，N為陰性對(duì)照孔OD值，以P/N≥2.1判為陽性，P/N<2.1判為陰性。分子生物學(xué)檢查方法方法采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，以線粒體COXI基因?yàn)榘谢?，?duì)螨蟲特異性DNA片段進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)。操作方法DNA的提取根據(jù)市售的微量基因組DNA提取試劑盒說明書分別提取附錄痂皮和疥螨蟲體（事先在遇冷的研缽中加液氮研成粉末）的DNA，備用。PCR擴(kuò)增擴(kuò)增總體積為25μL，包括PCRMixture12.5μL，待檢樣品DNA模板1.0μL，上、下游引物各1.0μL（10pmol/μL，引物序列5’-GTGTGGAACTGGTAGAGG-3’，5’-CAGATCAAGCAAAAAGAGTTAAG-3’），滅菌蒸餾水加至25.0μL。同時(shí)設(shè)置疥螨DNA的陽性對(duì)照組和設(shè)置滅菌蒸餾水的陰性對(duì)照組。擴(kuò)增條件如下：94?°C預(yù)變性3min；94?°C變性30?s，54°C復(fù)性20?s，72?°C延伸20s，35個(gè)循環(huán)；72?°C延伸8min；8℃儲(chǔ)存10min。產(chǎn)物預(yù)期大小為212bp。結(jié)果判定取6μLPCR產(chǎn)物（包括待檢樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照）及5μLDNA標(biāo)準(zhǔn)Marker，加入1.8%X脂糖凝膠板的孔內(nèi)（含Goldview核酸染料），經(jīng)5V/cm電泳，電泳20min，于紫外凝膠成像儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立條件：XX性對(duì)照出現(xiàn)212bp擴(kuò)增條帶，空白對(duì)照未出現(xiàn)目的條帶。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立的情況下，待檢樣品出現(xiàn)預(yù)期大?。?12bp）條帶即為陽性（見圖E.1）。PCR方法標(biāo)準(zhǔn)陽性擴(kuò)增結(jié)果注：M，DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量（TakaRa）;1，標(biāo)準(zhǔn)陽性擴(kuò)增結(jié)果;2，陰性對(duì)照若需要進(jìn)一步確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果，可將電泳檢測(cè)呈陽性的PCR剩余產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序，疥螨COXI基因參考序列（212bp）為：GTGTGGAACTGGTAGAGGAACTGGCTGAACTATTTATCCTCCTTTATCTAGAATCACTTATCATTCAAATATGTCTGTAGATTTTACAATTGTAAGATTACATATTGCTGGAATTTCTTCTATTTTAAGTTCTATCAATTTTATTGTAACTATTTATAATATAAAAATAAAAGGAATAAGATGATCAAACTTAACTCTTTTTGCTTGATCTG參考文獻(xiàn)[1]郝桂英，楊光友，賴松家，等.

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