鹽酸米托脂質(zhì)體抗腫瘤作用的研究

鹽酸米托脂質(zhì)體抗腫瘤作用的研究

托吡魯酯環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物可以被移植到具有修復(fù)意圖的堿基中，阻止dna合成和轉(zhuǎn)移，并造成dna鏈結(jié)構(gòu)的損傷。此外,米托蒽醌也能干擾RNA的合成,并且還是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的有效抑制劑,從而導(dǎo)致基因組DNA的崩解。米托蒽醌對(duì)體外培養(yǎng)活躍期和非活躍期細(xì)胞都有細(xì)胞毒作用,為細(xì)胞周期非特異性藥物。米托蒽醌進(jìn)入血液后大部分(95%以上)迅速與血漿蛋白結(jié)合,造成嚴(yán)重的毒副作用,如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)及心臟毒性,限制了其臨床用量及療效提高。脂質(zhì)體作為抗腫瘤藥物的載體,可以減少藥物在正常組織的分布,增加藥物在腫瘤組織的蓄積,從而降低藥物毒性,改善藥物的治療指數(shù)。美國(guó)Neopharm公司通過(guò)在HSPC磷脂雙分子層中添加荷負(fù)電的心磷脂,采用被動(dòng)載藥技術(shù)將米托蒽醌包裹于脂質(zhì)雙層中。加拿大INEX公司通過(guò)使用DSPC和DMPC二種不同磷脂,采用主動(dòng)載藥技術(shù)(pH梯度法)制備了大單室脂質(zhì)體,結(jié)果證明使用DMPC的處方可以加快藥物釋放,改善治療效果。本課題組也對(duì)米托蒽醌脂質(zhì)體的制備進(jìn)行了研究,首先采用硫銨梯度法制備了不同PEG含量及不同磷脂組成的脂質(zhì)體,通過(guò)小鼠體內(nèi)藥代、分布、毒性和藥效實(shí)驗(yàn)證明HSPC磷脂和高PEG含量處方可以顯著提高米托蒽醌的治療指數(shù)。隨后又證明縮小脂質(zhì)體粒徑可以優(yōu)化米托蒽醌脂質(zhì)體的釋放,提高療效。本文對(duì)一個(gè)優(yōu)選的鹽酸米托蒽醌脂質(zhì)體(Mit-lipo)處方采用人PC-3前列腺癌異體移植瘤模型評(píng)價(jià)其抗腫瘤作用,通過(guò)犬與荷瘤鼠的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布實(shí)驗(yàn)比較了其與鹽酸米托蒽醌游離藥(Mit-free)體內(nèi)行為的差異。動(dòng)物、儀器和藥動(dòng)學(xué)藥物和試劑Mit-lipo[石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)(石家莊)有限公司研制,每支10mL,10mg,批號(hào)070501];Mit-free(重慶凱林制藥有限公司,含量99.4%,批號(hào)M20070104)。藥品臨用前以5%葡萄糖注射液稀釋;甲醇,乙腈(色譜純,Fisher公司);冰醋酸(分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司);庚烷磺酸鈉(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心,純度:99.5%);PRMI1640培基(Sigma公司);胎牛血清(Gibco產(chǎn)品);Trypsin1∶250(Sigma公司);5%葡萄糖注射液(石家莊四藥有限公司)。細(xì)胞小鼠S-180細(xì)胞株,人前列腺癌PC-3細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。S-180細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,PC-3細(xì)胞置于含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液中,37℃,飽和濕度、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。動(dòng)物清潔級(jí)昆明小鼠(河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體重18~22g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK[冀]2008-1-003;Beagle犬(廣州醫(yī)藥工業(yè)研究所),雌雄各半,體重8~10kg,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2003-0007;5~6周齡的BALB/c雄性裸鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK[京]2007-0001,裸鼠飼養(yǎng)于清潔環(huán)境中的SPF層流柜。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(冀)2006-0046。儀器及設(shè)備IX70型倒置熒光顯微鏡(Olympus公司);液相色譜輸液泵:Waters2690系統(tǒng)泵,四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱(美國(guó)Waters公司);紫外檢測(cè)器:Waters996型二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司);數(shù)據(jù)系統(tǒng):Millennium32軟件(美國(guó)Waters公司)。對(duì)PC-3實(shí)體瘤的體內(nèi)抑制作用收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人前列腺癌PC-3細(xì)胞,將瘤細(xì)胞懸液接種于5~6周BALB/c雄性小鼠前肢腋下皮下組織,接種體積為0.15mL,含瘤細(xì)胞數(shù)約1.2×106個(gè)。接種完成后,剩余瘤細(xì)胞懸液在光鏡下計(jì)數(shù),活瘤細(xì)胞數(shù)>95%。接種28天后,挑選腫瘤體積為100~300mm3的小鼠,按腫瘤體積大小將動(dòng)物隨機(jī)均勻分為Mitlipo的1、2和4mg·kg-1劑量組,Mit-free的2mg·kg-1劑量組及空白5%葡萄糖注射液組,分別靜脈給藥,6天后根據(jù)體重進(jìn)行第2次給藥,給藥容積均為20mL·kg-1。使用測(cè)量瘤徑的方法,動(dòng)態(tài)觀察受試藥的抗腫瘤作用。在給藥后第4、6、8、11、14、18、20、24和26天測(cè)量瘤徑,同時(shí)稱量小鼠體重。腫瘤體積(tumorvolume,V)的計(jì)算公式為:V=1/2×a×b2。其中a、b分別表示腫瘤長(zhǎng)寬,根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算腫瘤體積。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,Repeatedmeasure過(guò)程分析隨時(shí)間變化各次測(cè)量間腫瘤體積的變化趨勢(shì),Multivariate過(guò)程比較各次測(cè)量時(shí)組間腫瘤體積差異。犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)測(cè)定18只Beagle犬按性別及體重指數(shù)均分為3組,分別為Mit-lipo0.2、0.4和1.0mg·kg-1組;0.2mg·kg-1組6只犬經(jīng)過(guò)3周的洗脫期后給予Mit-free1.0mg·kg-1。分別于給藥后不同時(shí)間(15、30、45min和1、2、4、8、24、48、72、96、120h)從前肢靜脈取血1mL置肝素抗凝管中。采用HPLC法測(cè)定血漿中米托蒽醌的藥物濃度,色譜柱為ZorbaxSB-C18分析柱(150mm×4.6mm,5μm,Agilent公司,SN:USCM014615),C18預(yù)置柱(4mm×3.0mm,Phenomenex,Torrance,CA,USA);檢測(cè)波長(zhǎng)655nm;流動(dòng)相:乙腈與庚烷磺酸鈉緩沖液(庚烷磺酸鈉2.01g,冰醋酸4.5mL,水500mL)64∶36(v/v);柱溫30℃;流速1.0mL·min-1。取犬血漿200μL,加入蛋白沉淀劑400μL[乙腈-甲醇(含0.5mol·L-1HCl)=10∶90,v/v],渦流混合30s,室溫放置30min,離心(11000r·min-1)15min后,取上清液20μL進(jìn)樣,記錄色譜圖。采用DAS(ver2.1.1)藥動(dòng)學(xué)軟件對(duì)實(shí)測(cè)的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算,再運(yùn)用SPSS(ver11.5)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行成組t檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)和相關(guān)性檢驗(yàn)。荷瘤小鼠體內(nèi)組織分布測(cè)定選取腫瘤邊界清晰、腫瘤塊大小約為10mm×10mm的S180荷瘤雄性小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取小鼠12只,隨機(jī)分為Mit-lipo和Mit-free組,以4mg·kg-1劑量分別靜脈給藥。給藥后1、4、8和24h將小鼠斷頸處死,迅速解剖,取出心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、小腸、骨髓和腫瘤組織,用生理鹽水洗去殘留血液及內(nèi)容物,濾紙吸干,稱重,-20℃保存待檢。采用HPLC法測(cè)定組織樣品中米托蒽醌的藥物濃度,條件同上。取骨髓、肝臟、心臟、腎臟、脾和肺組織樣品0.05g,小腸和腫瘤組織樣品0.1g,分別置于2mL離心管中,加入20%抗壞血酸溶液0.4mL,用組織勻漿機(jī)研磨處理,制成組織勻漿液。取組織勻漿液200μL,加入蛋白沉淀劑200μL[乙腈-甲醇(含0.5mol·L-1HCl)=10∶90],渦流混合30s,室溫放置30min,離心(11000r·min-1)15min后,取上清液50μL進(jìn)樣,記錄色譜圖。結(jié)果1對(duì)大鼠體重、空白對(duì)等質(zhì)量的影響實(shí)驗(yàn)期間空白對(duì)照組和Mit-lipo各劑量組動(dòng)物無(wú)死亡,Mit-free2mg·kg-1劑量組中1只裸鼠因藥物毒性死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)Mit-free治療組動(dòng)物體重比給藥前下降3.4%,Mit-lipo各劑量組動(dòng)物體重均有不同程度的增長(zhǎng)(12.4%、10.7%和18.4%),空白對(duì)照組體重增加了19.5%。Mit-lipo對(duì)PC-3腫瘤的抑制作用見(jiàn)圖1。數(shù)據(jù)表明,Mit-free2mg·kg-1兩次給藥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有延遲作用,但無(wú)顯著性差異(P>0.05);Mit-lipo各劑量組在首次給藥后第11天開(kāi)始呈顯著劑量依賴性地抑制腫瘤的生長(zhǎng)(P<0.05)。2狗體內(nèi)藥物的動(dòng)態(tài)參數(shù)2.1回收率和精密度色譜條件下血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物的測(cè)定;米托蒽醌的血漿濃度在0.10~50mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)在0.9976~0.9979,定量下限為0.10mg·L-1米托蒽醌低、中、高3個(gè)濃度(0.20、2.0和40.0mg·L-1)的回收率分別為88.0%、98.2%和92.5%;日內(nèi)精密度均小于10.8%,日間精密度均小于13.1%,最低定量濃度(LLOQ)點(diǎn)的日內(nèi)精密度均小于8.60%。樣品-20℃冷凍保存30天穩(wěn)定。2.2等劑量對(duì)質(zhì)粒大鼠auc/1的影響Mit-lipo在犬體內(nèi)0.2~1.0mg·kg-1呈線性動(dòng)力學(xué)特性(表1),與1.0mg·kg-1的Mit-free相比,等劑量Mit-lipo的AUC和t1/2更高,清除速率更低,分布容積更小。3荷塘瘤鼠組織的分布3.111111115.1.4.315.5%15.5m色譜條件下生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物的測(cè)定;米托蒽醌的組織勻漿濃度在0.01~5mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)在0.9954~0.9984;米托蒽醌(0.02,0.2和4mg·L-1)的回收率95%~116%,日內(nèi)精密度均小于5.76%,最低定量濃度(LLOQ)點(diǎn)的日內(nèi)精密度均小于5.16%。3.2與正常組織的靶向性比較與4mg·kg-1的Mit-free相比,等劑量的Mit-lipo在腫瘤組織中米托蒽醌的峰濃度和AUC更高(表2),表明脂質(zhì)體制劑Mit-lipo對(duì)于腫瘤組織具有顯著的靶向性。Mit-lipo在大多數(shù)正常組織中(心、腎、肺、脾和腸組織)米托蒽醌峰濃度和AUC較低。如Mit-lipo在心、腎、肺、脾和腸組織中米托蒽醌的峰濃度比等劑量的Mit-free分別低30.2%、161.6%、20.2%、27.9%和78.3%。在藥藥方面的應(yīng)用大多數(shù)抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤的靶向性不明顯,常常對(duì)人體正常組織造成不可逆的損傷,不利于癌癥的治療。抗腫瘤藥物脂質(zhì)體對(duì)腫瘤組織具有靶向性和緩釋性,在腫瘤組織能保持較高的藥物濃度,持續(xù)作用時(shí)間長(zhǎng),減少了抗腫瘤藥物的副作用,顯示了其特有的優(yōu)越性。但并不是所有的脂質(zhì)體處方均可以改善療效,降低毒性,治療效果的改善依賴于藥物的靶向效率和釋藥速率的交互作用。本實(shí)驗(yàn)研究證明Mit-lipo在犬體內(nèi)具有更高的AUC和t1/2,更低的清除速率和更小的分布容積,其AUC0-t、Cmax和t1/2分別為等劑量Mit-free的10766、39和177倍,表明Mit-lipo在體內(nèi)具有長(zhǎng)循環(huán)的特點(diǎn)。荷瘤鼠組織分布實(shí)驗(yàn)表明Mit-lipo對(duì)腫瘤組織具有顯著的靶向性,這與Mit-lipo可以顯著提高米托蒽醌對(duì)人前列腺癌PC-3移植瘤抑瘤作