復(fù)合酶輔助法提取人參總皂苷工藝研究

復(fù)合酶輔助法提取人參總皂苷工藝研究

人參屬5個加科，主要用于身體和心靈疾病的治療。人參中含皂苷類、糖類、蛋白質(zhì)、揮發(fā)性成分、黃酮類、維生素、酶類、木質(zhì)素以及微量元素等成分,其有效成分之一為人參總皂苷,具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、抗衰老、溶血及抗溶血、鎮(zhèn)痛、抗補(bǔ)體等作用,對人體神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有廣泛的生物活性,并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床實踐。人參總皂苷的提取方法較多,如浸漬法、回流法、超聲波法、超臨界萃取法和微波法等,但是提取率一般不高?？紤]到植物的有效成分大多被細(xì)胞壁包裹,而細(xì)胞壁的成分主要為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白等,利用復(fù)合酶處理,可改變植物細(xì)胞壁的通透性,有利于更有效地提取有效成分。本研究嘗試運(yùn)用復(fù)合酶輔助提取法,提高人參總皂苷提取率,提高人參資源的利用率。1材料和方法1.1人參皂苷re人參:為平地栽參地下部分制成的生曬參,由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)張連學(xué)教授鑒定為4年生全須生曬參。莖葉:為6年生平地栽參地上部分,粉碎,過60目篩,備用。人參皂苷Re,中國食品藥品檢定研究院;中溫淀粉酶、中性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶、甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶,蘇州昆藍(lán)生物科技有限公司;香草醛、無水乙醇、濃硫酸等均為分析純。1.2紫外分光光度計百靈LA114型電子天平,常熟市百靈天平儀器有限公司;UV-754紫外可見分光光度計,山東高密彩虹分析儀器有限公司;LD5-2A型低速離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠;SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器,金壇市江南儀器廠;HH-W-600型數(shù)顯恒溫水箱,金壇市江南儀器廠。1.3最佳提取工藝的確定考慮到不同生物酶的作用對象不同,在實驗過程中,首先通過單因素實驗,優(yōu)選出若干種對人參總皂苷提取作用明顯的生物酶及其作用條件,然后通過正交試驗考察各因素之間(包括所選的各種生物酶之間及其反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度)的復(fù)合作用,最終確定人參總皂苷的最佳提取工藝。1.3.1不同酶最佳提取條件的確定選用中溫淀粉酶、中性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶、甘露聚糖酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶9種酶,在酶各自的適宜條件下對人參根及莖葉總皂苷進(jìn)行提取,分別考慮各單酶的最佳提取條件。1.3.2復(fù)合酶法提取人參根及莖葉總皂苷的正交試驗以單因素酶解試驗為基礎(chǔ),對人參根進(jìn)行正交試驗L9(3)4,對人參莖葉進(jìn)行正交試驗L18(3)5,確定復(fù)合酶法提取人參根及莖葉總皂苷的最佳條件,優(yōu)化提取工藝。1.3.3統(tǒng)計方法2結(jié)果與討論2.1香草醛-乙醇溶液的制備精密量取人身皂苷Re對照品溶液20、40、60、80、120、160、200μl,分別置于10ml具塞試管中,以相應(yīng)試劑為空白。放置于60℃恒溫水浴鍋中揮干后,放置于冰水中;分別加16%香草醛-乙醇溶液0.5ml和77%濃硫酸5ml,搖勻,置于60℃水浴鍋中反應(yīng)10min后,再冰水浴15min;紫外可見分光光度計于544nm測定吸光度,以皂苷含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:y=0.00411x-0.0718,r2=0.9990。2.2單因素實驗2.2.1不同酶提取處理對人參皂苷得率影響取9份干燥人參根粉末各0.5g,精密稱定,置于100ml三角瓶中,分別加入中溫淀粉酶等9種單酶。加酶量為人參粉末質(zhì)量的5‰,加入50ml水。分別于25℃、40℃、60℃恒溫振蕩水浴3h,再于100℃水浴提取2h。分別測定不同種類的酶在不同溫度下的人參根總皂苷提取率,結(jié)果見表1。從表1中可以看出,提取溫度對人參皂總苷的提取率有影響。在60℃條件下總皂苷得率最高,25℃次之;且在這兩種溫度下,加酶組總皂苷得率普遍高于空白對照。40℃皂苷得率最低。效果最好的酶是中溫淀粉酶、中性蛋白酶。2.2.2反應(yīng)溫度對總皂苷提取率的影響以中溫淀粉酶和中性蛋白酶處理人參根。分別測定加酶量為底物含量的0、1‰、5‰、1%、5%,反應(yīng)溫度為60℃時總皂苷的提取率。結(jié)果見表2。由表2可知,中溫淀粉酶的加酶量為1%時,皂苷的提取率最高。中性蛋白酶的加酶量為5%時,皂苷的提取率最高。2.2.3聚糖酶的提取取人參莖葉粉末0.5g,精密稱定,置于100ml三角瓶中,分別加入藥材量5‰的中溫淀粉酶、中性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶、甘露聚糖酶。加入50ml蒸餾水,60℃恒溫水浴振蕩3h,再置于100℃恒溫水浴鍋中提取2h。分別測定不同種類的酶對人參莖葉總皂苷提取率的影響。結(jié)果見表3。由表3可知,在溫度為60℃時,人參莖葉在纖維素酶、漆酶及甘露聚糖酶的作用下有較高的總皂苷提取率。而在其他酶作用下,莖葉皂苷總提取率低于或接近無酶條件。2.2.4加酶量為底物含量的總皂苷的提取率以纖維素酶、漆酶、甘露聚糖酶處理人參莖葉,分別測定反應(yīng)溫度為60℃時,加酶量為底物含量的0、1‰、5‰、1%、5%時總皂苷的提取率。結(jié)果見表4。由表4可知,三種酶均在5%加酶量時皂苷提取率最高,且每種酶的1%和5%加酶量的皂苷提取率均比較接近。2.3正交試驗設(shè)計2.3.1復(fù)合酶法提取人參根總皂苷的最優(yōu)條件根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,以中溫淀粉酶(%)、中性蛋白酶(%)、時間(h)、溫度(℃)為因素,設(shè)計L9(3)4正交試驗。因素水平、直觀分析及方差分析如表5、表6及表7所示。由表6可以看出,各個因素對人參根總皂苷的提取率的影響程度依次為:中溫淀粉酶>中性蛋白酶>時間>溫度。復(fù)合酶法提取人參根總皂苷的最佳條件為:A3B2C1D3。表7顯示,A、B、C、D四個因素中并無顯著因素。即4個因素對人參根總皂苷的提取率作用都不明顯,但各因素比較,因素A和B明顯高出因素C和D。所以在使用酶法提取人參根皂苷時,應(yīng)注重酶用量。結(jié)合直觀分析、方差分析、酶的特性以及從能量消耗和節(jié)約時間等方面考慮,確定最佳提取工藝為A3B2C1D3,即:中溫淀粉酶用量5%,中性蛋白酶用量1%,反應(yīng)時間2h,反應(yīng)溫度60℃。在此條件下進(jìn)行驗證試驗,人參根總皂苷提取率分別為5.55%、5.52%、5.43%,其平均提取率為5.50%。2.3.2正交實驗結(jié)果根據(jù)單因素的實驗結(jié)果,以漆酶(%)、纖維素酶(%)、甘露聚糖酶(%)、時間(h)、溫度(℃)為因素設(shè)計L18(3)5正交試驗,其因素水平、直觀分析及方差分析如表8、表9及表10所示。由表9可知,在A、B、C、D、E等5個因素中,對人參莖葉總皂苷提取率影響程度大小依次為:漆酶>纖維素酶>甘露聚糖酶>時間>溫度。其復(fù)合酶法提取人參莖葉總皂苷的最佳提取條件為A3B3C2D1E2。由表10可知,5個因素對人參莖葉總皂苷提取率皆無顯著性影響。但從表中可以看出,因素A和因素B的影響明顯高于其他3個因素。結(jié)合上述結(jié)果及節(jié)約能源和時間、酶的特性等方面考慮,確定最佳提取工藝為A3B3C2D1E2,即:漆酶用量5%,纖維素酶用量5%,甘露聚糖酶用量1%,反應(yīng)時間2h,反應(yīng)溫度40℃。在此條件下進(jìn)行驗證試驗,人參莖葉總皂苷提取率分別為11.75%、11.81%、11.89%,其平均提取率為11.82%。3復(fù)合酶法提取人參根和莖葉總皂苷,困難酶輔助法提取人參總皂苷的方法具有耗能少,提取率高,操作簡單等特點。無酶條件下人參根中總皂苷的提取率為3.22%,而復(fù)合酶最佳工藝的提取率為5.50%,總皂苷產(chǎn)率較無酶時提高近1倍。無酶條