差示法測(cè)定蘆丁的吸光度

差示法測(cè)定蘆丁的吸光度

蘆丁是植物中的一種常見(jiàn)藥物。如圖1所示，結(jié)構(gòu)如圖1所示。因具有抗菌消炎,抗氧化,清除人體內(nèi)過(guò)量活性氧自由基,抗輻射等作用,使其提取和分析備受重視。蘆丁的測(cè)定方法有HPLC法、紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳法等。本文研究了蘆丁在酸堿溶液中的紫外吸收行為建立了差示紫外吸收光度法,不經(jīng)分離,直接測(cè)定蘆丁片和槐米中的蘆丁。方法線性范圍寬,重現(xiàn)性好,操作簡(jiǎn)便。具有良好的應(yīng)用前景。1實(shí)驗(yàn)方法1.1溶液ro1WFZ-26A型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(天津拓普)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(250μg/mL):準(zhǔn)確稱取25mg蘆丁(中國(guó)藥品生物制品檢定所),用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶解并稀釋至100mL。0.1,0.01,0.001mol/LHCl溶液(pH1.0,pH2.0,pH3.0);HAc-NaAc緩沖溶液(pH4.0,pH5.0);Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(pH6.0,pH7.0);NH3-NH4Cl緩沖溶液(pH8.0,pH9.0,pH9.25,pH10.0,pH11.0);0.01,0.1,1.0mol/LNaOH溶液(pH12.0,pH13.0,pH14.0)?；泵姿幉馁?gòu)于青島鄭州路紫光藥店。蘆丁片(標(biāo)示量20mg/片,批號(hào)050301,臨汾寶珠制藥有限公司)。1.2緩沖溶液及ph的確定吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(250μg/mL)1.0mL2份于2支10mL比色管中,分別用pH9.25的NH4Cl-NH3緩沖溶液和0.01mol/LHCl(pH2.0)稀釋至10mL。以蘆丁堿溶液為測(cè)定液,以等濃度的蘆丁酸溶液為參比液,在405nm處測(cè)量吸光度差值ΔA,用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算。2結(jié)果與討論2.1黃酮類化合物的紫外光譜分析取1.0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(250(g/mL),分別用不同pH的緩沖溶液稀釋至10mL,以相應(yīng)的緩沖溶液為參比液,在190～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描,譜圖見(jiàn)圖2。黃酮類化合物的紫外光譜圖。有2個(gè)特征吸收區(qū)域。帶Ⅱ通常在240～280nm是由A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)引起的吸收帶,帶Ⅰ300～380nm是由B環(huán)肉桂酰系統(tǒng)引起的吸收帶。蘆丁在紫外區(qū)的2個(gè)吸收峰位置隨酸度不同而不同。在酸性介質(zhì)中(pH1.0～6.0)蘆丁2個(gè)吸收峰分別位于255、353nm,當(dāng)pH≥6.6時(shí)蘆丁分子中的酚羥基開(kāi)始不同程度的解離,由于每個(gè)酚陰離子上有一對(duì)外加的未共用電子對(duì)參與共軛,生色作用加強(qiáng),因而導(dǎo)致吸收峰紅移。pH≥10時(shí),帶Ⅱ位移至272nm,帶Ⅰ位移至410nm達(dá)最大值。2.2蘆丁的紫外光譜蘆丁的紫外光譜在酸性介質(zhì)中穩(wěn)定,在堿性介質(zhì)中的不穩(wěn)定。pH≥11時(shí),蘆丁的紫外光譜隨時(shí)間變化明顯。以50μg/mLpH14的蘆丁溶液每隔4min進(jìn)行一次光譜掃描,譜圖見(jiàn)圖3。蘆丁在強(qiáng)堿溶液中所有羥基都產(chǎn)生某種程度的離子化,且紫外光譜在幾分鐘內(nèi)便衰退。帶Ⅱ稍有紫移,帶Ⅰ變化明顯:410nm處的峰值不斷衰減,最終完全消失并在320nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰。2.3光譜掃描波長(zhǎng)以25μg/mL堿溶液(pH9.25)為測(cè)定液,以25μg/mL蘆丁酸溶液(pH2.0)為參比液,在190～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描,譜圖見(jiàn)圖4。兩個(gè)吸收峰分別位于274和405nm,選定405nm為測(cè)定波長(zhǎng)。2.4緩沖溶液和無(wú)砂緩沖液緩沖溶液配制分別移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(250μg/mL)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL各2份于20支10mL比色管中,分別用pH9.25的NH4Cl-NH3緩沖溶液和0.01mol/LHCl(pH2.0)稀釋至10mL。搖勻,5min后按1.2實(shí)驗(yàn)方法測(cè)其ΔA值,以ΔA對(duì)質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程ρ=36.98A-2.405,r=0.999。2.5系統(tǒng)的穩(wěn)定性按實(shí)驗(yàn)方法配制溶液,室溫下放置不同時(shí)間后進(jìn)行光譜測(cè)定,30min內(nèi)吸光度基本不變,可滿足分析要求。2.6蘆丁的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶在選定的條件下共存物質(zhì)對(duì)蘆丁的影響情況如下:100倍的Na+、K+、NH4+、F-、Cl-、I-、SO42-對(duì)蘆丁無(wú)影響;能和OH-生成沉淀的離子如:Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Al3+干擾蘆丁的測(cè)定。等量的葛根素對(duì)測(cè)定無(wú)影響,等量的槲皮素在選定的測(cè)定波長(zhǎng)下與蘆丁的吸光度比為3.2%。2.7樣品分析2.7.1加標(biāo)回收率測(cè)定取蘆丁片10片研細(xì)。準(zhǔn)確稱量0.0523g加適量的體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶解并定容至50mL,得供試液。各取1.0mL于2支10mL比色管中,按1.2實(shí)驗(yàn)方法測(cè)其ΔA值,用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算結(jié)果,同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)加入計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。2.7.2測(cè)定波長(zhǎng)的確定取已粉碎的槐米藥材2.000g,加入適量95%乙醇回流提取3次,得棕黃色溶液。測(cè)定前定容至100mL,各取0.2mL于2支10mL比色管中,按1.2實(shí)驗(yàn)方法測(cè)其ΔA值,用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算結(jié)果,同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)加入計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。本方法以蘆丁在酸堿溶液中具有不同結(jié)構(gòu)因而具有不同的紫外光譜特性為依據(jù),建立了差示紫外吸收光度法。以等濃