差示法測定蘆丁的吸光度

差示法測定蘆丁的吸光度

蘆丁是植物中的一種常見藥物。如圖1所示，結(jié)構(gòu)如圖1所示。因具有抗菌消炎,抗氧化,清除人體內(nèi)過量活性氧自由基,抗輻射等作用,使其提取和分析備受重視。蘆丁的測定方法有HPLC法、紫外分光光度法、毛細管電泳法等。本文研究了蘆丁在酸堿溶液中的紫外吸收行為建立了差示紫外吸收光度法,不經(jīng)分離,直接測定蘆丁片和槐米中的蘆丁。方法線性范圍寬,重現(xiàn)性好,操作簡便。具有良好的應(yīng)用前景。1實驗方法1.1溶液ro1WFZ-26A型紫外可見分光光度計(天津拓普)。蘆丁標準溶液(250μg/mL):準確稱取25mg蘆丁(中國藥品生物制品檢定所),用體積分數(shù)60%乙醇溶解并稀釋至100mL。0.1,0.01,0.001mol/LHCl溶液(pH1.0,pH2.0,pH3.0);HAc-NaAc緩沖溶液(pH4.0,pH5.0);Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(pH6.0,pH7.0);NH3-NH4Cl緩沖溶液(pH8.0,pH9.0,pH9.25,pH10.0,pH11.0);0.01,0.1,1.0mol/LNaOH溶液(pH12.0,pH13.0,pH14.0)?；泵姿幉馁徲谇鄭u鄭州路紫光藥店。蘆丁片(標示量20mg/片,批號050301,臨汾寶珠制藥有限公司)。1.2緩沖溶液及ph的確定吸取蘆丁標準溶液(250μg/mL)1.0mL2份于2支10mL比色管中,分別用pH9.25的NH4Cl-NH3緩沖溶液和0.01mol/LHCl(pH2.0)稀釋至10mL。以蘆丁堿溶液為測定液,以等濃度的蘆丁酸溶液為參比液,在405nm處測量吸光度差值ΔA,用標準曲線法計算。2結(jié)果與討論2.1黃酮類化合物的紫外光譜分析取1.0mL蘆丁標準溶液(250(g/mL),分別用不同pH的緩沖溶液稀釋至10mL,以相應(yīng)的緩沖溶液為參比液,在190～600nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描,譜圖見圖2。黃酮類化合物的紫外光譜圖。有2個特征吸收區(qū)域。帶Ⅱ通常在240～280nm是由A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)引起的吸收帶,帶Ⅰ300～380nm是由B環(huán)肉桂酰系統(tǒng)引起的吸收帶。蘆丁在紫外區(qū)的2個吸收峰位置隨酸度不同而不同。在酸性介質(zhì)中(pH1.0～6.0)蘆丁2個吸收峰分別位于255、353nm,當pH≥6.6時蘆丁分子中的酚羥基開始不同程度的解離,由于每個酚陰離子上有一對外加的未共用電子對參與共軛,生色作用加強,因而導(dǎo)致吸收峰紅移。pH≥10時,帶Ⅱ位移至272nm,帶Ⅰ位移至410nm達最大值。2.2蘆丁的紫外光譜蘆丁的紫外光譜在酸性介質(zhì)中穩(wěn)定,在堿性介質(zhì)中的不穩(wěn)定。pH≥11時,蘆丁的紫外光譜隨時間變化明顯。以50μg/mLpH14的蘆丁溶液每隔4min進行一次光譜掃描,譜圖見圖3。蘆丁在強堿溶液中所有羥基都產(chǎn)生某種程度的離子化,且紫外光譜在幾分鐘內(nèi)便衰退。帶Ⅱ稍有紫移,帶Ⅰ變化明顯:410nm處的峰值不斷衰減,最終完全消失并在320nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰。2.3光譜掃描波長以25μg/mL堿溶液(pH9.25)為測定液,以25μg/mL蘆丁酸溶液(pH2.0)為參比液,在190～500nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描,譜圖見圖4。兩個吸收峰分別位于274和405nm,選定405nm為測定波長。2.4緩沖溶液和無砂緩沖液緩沖溶液配制分別移取蘆丁標準溶液(250μg/mL)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL各2份于20支10mL比色管中,分別用pH9.25的NH4Cl-NH3緩沖溶液和0.01mol/LHCl(pH2.0)稀釋至10mL。搖勻,5min后按1.2實驗方法測其ΔA值,以ΔA對質(zhì)量濃度作標準曲線,回歸方程ρ=36.98A-2.405,r=0.999。2.5系統(tǒng)的穩(wěn)定性按實驗方法配制溶液,室溫下放置不同時間后進行光譜測定,30min內(nèi)吸光度基本不變,可滿足分析要求。2.6蘆丁的生長和產(chǎn)酶在選定的條件下共存物質(zhì)對蘆丁的影響情況如下:100倍的Na+、K+、NH4+、F-、Cl-、I-、SO42-對蘆丁無影響;能和OH-生成沉淀的離子如:Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Al3+干擾蘆丁的測定。等量的葛根素對測定無影響,等量的槲皮素在選定的測定波長下與蘆丁的吸光度比為3.2%。2.7樣品分析2.7.1加標回收率測定取蘆丁片10片研細。準確稱量0.0523g加適量的體積分數(shù)60%乙醇溶解并定容至50mL,得供試液。各取1.0mL于2支10mL比色管中,按1.2實驗方法測其ΔA值,用標準曲線法計算結(jié)果,同時做標準加入計算回收率。結(jié)果見表1。2.7.2測定波長的確定取已粉碎的槐米藥材2.000g,加入適量95%乙醇回流提取3次,得棕黃色溶液。測定前定容至100mL,各取0.2mL于2支10mL比色管中,按1.2實驗方法測其ΔA值,用標準曲線法計算結(jié)果,同時做標準加入計算回收率。結(jié)果見表1。本方法以蘆丁在酸堿溶液中具有不同結(jié)構(gòu)因而具有不同的紫外光譜特性為依據(jù),建立了差示紫外吸收光度法。以等濃