反硝化細菌的研究進展

反硝化細菌的研究進展

隨著世界經(jīng)濟的快速發(fā)展，環(huán)境問題，尤其是水環(huán)境問題，日益嚴(yán)重。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)長期大量使用化肥,養(yǎng)殖水體積累了大量的魚類糞便和餌料殘渣,導(dǎo)致水體氮素含量嚴(yán)重超標(biāo),形成水體氮污染,其中亞硝酸鹽能氧化魚蝦體內(nèi)的亞鐵血紅蛋白,使其成為高鐵血紅蛋白,喪失運輸氧氣的能力,導(dǎo)致水生生物大批患病甚至死亡,嚴(yán)重影響水質(zhì)和水產(chǎn)品安全。近年來國內(nèi)外對氮污染的治理日益重視,目前微生態(tài)技術(shù)是當(dāng)前水環(huán)境污染治理的研究熱點。微生物的反硝化作用是地球氮素循環(huán)的重要分支,在水產(chǎn)養(yǎng)殖污染水體脫氮修復(fù)中起重要作用。其關(guān)鍵酶與細菌反硝化性能的強弱密切相關(guān),許多學(xué)者對反硝化細菌的各種反硝化酶進行研究。本文從反硝化酶系和環(huán)境因子兩方面,對反硝化作用的影響進行了系統(tǒng)論述,旨在為反硝化細菌在水體氮污染控制的深入研究提供理論基礎(chǔ)。1反硝化反應(yīng)反硝化作用又稱脫氮作用或硝酸鹽呼吸作用,即硝酸鹽或者亞硝酸鹽被還原成氣態(tài)氮化物(主要是N2,少量是N2O)的過程。反硝化過程主要包括如下四個反應(yīng):NO–3→NO2–→NO→N2O→N2。這四步反應(yīng)細菌分別利用硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶四種酶完成。1.1硫氰酸鹽nap細菌好氧反硝化的第一步是硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,由硝酸還原酶催化。反硝化菌通常包含一種或兩種硝酸還原酶,一種是膜結(jié)合硝酸還原酶(NAR),另一種為周質(zhì)硝酸還原酶(NAP)。NAR在厭氧條件下優(yōu)先表達,且僅在厭氧狀態(tài)下發(fā)揮作用;NAP在有氧條件下優(yōu)先表達,也存在于厭氧生長的細胞中,當(dāng)NAR被氧抑制時,它仍具有硝酸還原能力。NARNAR是一個由3個亞基組成的復(fù)合物NarGHI,屬于鉬喋呤氧化還原酶家族。亞基NarI將酶固定到膜上,接受來自醌的電子,通過兩個亞鐵血紅素b將電子傳遞到NarH;NarH通過鐵硫鍵將電子傳遞到NarG胞質(zhì)一側(cè)的活性位點—鉬協(xié)作因子或核苷鉬輔因子;同時硝酸鹽在還原過程中形成NO2–和H2O,釋放到周質(zhì),電子傳遞到NarI=。氧氣以限制硝酸根通過細胞質(zhì)膜來間接抑制此酶的活性,使之在有氧條件下失活。NAR存在于Escherichiacoli、Pseudomonsdenitrificans、Bacilluslicheniformis、Bacillusstearothermophilus、Paracoccusdenitrification等微生物中。NAPNAP是由2個亞單位(NapA和NapB)組成的二聚體。大亞基NapA由基因napA編碼,為還原硝酸鹽的作用位點,包含輔因子鉬蝶呤鳥苷二核苷酸(MGD)和一個鐵硫中心。NapB由基因napB編碼,為二血紅素細胞色素C552。鐵硫中心協(xié)助血紅素c和MGD之間的電子傳遞。NapC編碼一種四血紅素c型細胞色素,有兩個結(jié)構(gòu)域,每個結(jié)構(gòu)域包含一個雙血紅素,每個血紅素末梢都有一個組氨酸殘基。NapC在周質(zhì)中表達,負責(zé)將電子從泛醌傳遞到NapAB。與NAR相比,NAP對硝酸根有更高的底物專一性,對疊氮化物的抑制不敏感;硫氰酸鹽可以競爭性地與NAP結(jié)合,是NAP的一種抑制劑。目前,一些細菌,如Haemophilusinfluenzae、Rhodobactersphaeroides、Pseudomonassp.和Sulfurimonasdenitrificans等編碼NAP的基因先后被鑒定。1.2維cu-nir基因在反硝化過程中,由亞硝酸還原酶(NIR)催化亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變成一氧化氮,實現(xiàn)了水體中的氮向大氣中氮的轉(zhuǎn)變,在反硝化過程中扮演了重要角色。NIR分布于細胞壁與細胞膜之間,根據(jù)其輔基的不同一般分為由nirS編碼的血紅素cd1型亞硝酸還原酶(cd1-NiRs)和由nirK編碼的銅型亞硝酸還原酶(Cu-NiRs),它們分別以血紅素cd1和Cu作為輔基。通常由于反硝化NIR類型有排外性,NirK和NirS雖然等價,生態(tài)位分化導(dǎo)致每個菌體只存在其中的一種。Cu-NiRCu-NiR是可溶性三角形酶,每個單體有兩個銅中心,Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型Cu為電子進入位點,主要的電子供體為天青蛋白和假天青蛋白,Ⅱ型Cu為底物結(jié)合位點,受His100,His135和His306調(diào)控。電子從Ⅰ型Cu中心,通過Asp和His的化學(xué)途徑傳遞到Ⅱ型Cu中心,還原NO2–為NO。有研究證實Thiosphoerapanto-tropha、Bdellovibriobacteriovorus、Chromobacteriumviolaceum、Pseudoalteromonashaloplanktis和Bacillusazotoformans中都存在Cu-NiR。此外,一些Neisseria菌中存在另一種位于外部膜的亞硝酸鹽還原酶AniA,為Cu-NiR的同源體。cd1-NiRcd1-NiR是一種雙功能酶,催化NO2–得到一個電子轉(zhuǎn)變成NO,使O2得到4個電子生成水。細胞色素cd1-NiR為同二聚體周質(zhì)蛋白質(zhì),每個單體上含有兩個亞鐵血紅素基團,c型和d1型。其電子供體為天青蛋白、細胞色素c551或假天青蛋白,電子通過c型血紅素傳遞到d1型血紅素,NO2–結(jié)合在d1血紅素上還原為NO(圖3)。研究表明,許多菌中都可分離到細胞色素cd1-NiR,包括Stenotrophomonasmaltophilia、Pseudomo-nasaeruginosa、Thiosphaerapantotropha、proteobacteria,Pseudomonasdenitrificans和Paracoccuspantotrophus。1.3金屬離子檢測一氧化氮還原酶(NOR)催化一氧化氮還原為一氧化二氮形成N-N鍵,該酶屬于亞鐵血紅素-銅氧化酶,根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu),可分為三種:cNor、qNor和qCuNor。cNorcNor為膜結(jié)合細胞色素bc型酶,也稱短鏈Nor(scNor),由cnorB基因編碼,包含一個小亞基NorC和一個大亞基NorB。NorC固定于質(zhì)膜,包含一個亞鐵血紅素c,配合一個保守組氨酸和一個蛋氨酸,將電子傳遞到催化單元NorB。NorB為一膜錨定蛋白,包含兩個亞鐵血紅素b和一個非亞鐵血紅素鐵。其中一個亞鐵血紅素b,配合兩個保守組氨酸,將電子轉(zhuǎn)移到二金屬雙核催化反應(yīng)中心,釋放N2O到周質(zhì)。在亞鐵細胞色素c作為電子供體的條件下,此酶顯示出很高的一氧化氮還原酶活性。研究發(fā)現(xiàn)cnorB基因類型的菌有Pseudomonasaeruginosa、Pseudomonassrutzeri、Paracoccusdenitrfican、Halomonashalodenitrficans、Rhodobactersphaerroides、Bradyrhizobiumjaponicum和Alcaligenesfaecalis。qNor在Ralstoniaeutropha中發(fā)現(xiàn)另一種一氧化氮還原酶qNor,也稱NorZ或長鏈Nor(lcNor)。該酶是單體酶,由qnorB基因編碼。qNor多肽鏈與cNor有很高的同源性,由一個N端延伸和一個C端域組成。其N端為對苯二酚結(jié)合位點,C端類似于cNor酶的催化亞基NorB。該酶在反硝化和非反硝化細菌中都有,而后者經(jīng)常有致病性。Hendriks,etal.研究表明含有qNor酶的菌主要有Staphylococcusaureus、Bacillusstearother-mophilus、Mycobacteriumavium、Corynebacteriumdiph-theriae、Synechocystissp.和Ralstoniaeutropha。qCuANor革蘭氏陽性菌中存在第三種類型的一氧化氮還原酶qCuANor。該酶含有兩個亞基,最大的催化亞基類似NorB,含有兩個亞鐵血紅素b,小亞基利用CuA位點獲得電子傳遞到催化亞基。該酶利用延胡索酸和細胞色素c551為電子供體,前者作用于一氧化氮脫毒作用,后者作用于反硝化。qCuANor僅在Bacillusazotofor-mans中,而其編碼基因尚未發(fā)現(xiàn)。1.4urple型二聚體酶一氧化二氮還原生成氮氣,為完全反硝化的最終步驟,催化該反應(yīng)的一氧化二氮還原酶(N2OR),為多銅二聚體酶,由nosZ基因編碼其催化中心。在革蘭氏陰性菌中為周質(zhì)酶,革蘭氏陽性菌中為膜結(jié)合酶。好氧與厭氧反硝化菌中分離出的N2OR在分子性質(zhì)上非常相似。根據(jù)氧化還原特性和光譜學(xué)分析,可分為Ⅰ型(purple型)和Ⅱ型(pink型),其中Ⅱ型是從有氧狀態(tài)下的培養(yǎng)物中分離而來。該同型二聚體酶每個亞基都包含6個Cu原子,它們排列成2個不同類型的多聚銅活性中心,一個是雙核電子傳遞位點CuA;另一個是四核催化位點CuZ。CuA從細胞色素c、延胡索酸或假天青素得到電子,傳遞到亞基CuZ,在此N2O還原成N2。N2OR從Pseudomonasstutzeri首次分離得到,其后陸續(xù)在其他菌中發(fā)現(xiàn):Pseudomonasstutzeri、Rhodobactercapsulatus、Wolinellasuccinogenes、Achromobactercyclo-clastes、Pseudomonasaeruginosa、Paracoccuspantotro-phus、Alcaligenesxylosoxidans、Pseudomonasnautica等。通常攜帶nirS的菌也帶有nosZ,極少例外,而攜帶nirK的菌更多使用不完全反硝化途徑,推測與其進化機制有關(guān)。2環(huán)境要素的定義對微生物生長發(fā)育具有直接或間接影響的環(huán)境要素,被稱為環(huán)境因子。環(huán)境因子如電子受體、碳源、碳氮比、溶解氧、pH和溫度等,為反硝化的重要影響因素。2.1電子受體的結(jié)構(gòu)作為電子受體,硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮是控制反硝化效率的最直接因素。在Verbaenderta,etal.的研究中,70.5%反硝化菌以硝酸鹽為電子受體,45.5%以亞硝酸鹽為電子受體,18.2%該兩種電子受體都能利用,95.5%能以兩者的復(fù)合物為電子受體。Paracoccuspantotrophus以氧和硝酸鹽共同作為電子受體時其生長速率高于以單一底物作為電子受體時的速率,最后獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)率也最高,缺少NO–3或O2都會降低細菌的生長率和反硝化率。有研究表明,NO–3濃度越高,Pseudomonasmandelii反硝化基因表達更持久。2.2不同溶劑對氧反硝化菌群落的影響反硝化菌以有機碳為主要電子供體,碳源含量為影響好氧反硝化的主要因素。Bernat,etal.利用活性污泥處理無碳源的合成廢水時脫氮率為1.54mg[N]/L,而處理投加醋酸鈉的配制廢水時脫氮率達到22.50mg[N]/L,說明好氧反硝化菌外源呼吸比內(nèi)源呼吸效率高。在對群落和碳源關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn),醋酸對污水處理廠發(fā)現(xiàn)的反硝化菌Thauera和Acidovorax具有選擇作用;乙醇或甲醇可以誘導(dǎo)出獨特的反硝化群落,而且對cd1-NiR反硝化菌影響更大。在乙酸鈉和丁二酸鈉為碳源時,反硝化菌對亞硝酸鹽氮的去除率最高,而對乳酸、蔗糖的碳源利用率較低,亞硝酸鹽氮去除率相對較小,可見菌對小分子碳源的利用率較高,而對大分子碳源的利用率較低。2.3生物反應(yīng)器中反硝化菌群C/N在反硝化過程中同樣也起著很重要的作用,脫氮率隨C/N的提高而增加。Citrohucterdiversus以醋酸為碳源且C/N為4—5時可得到最佳的反硝化活性,該C/N較缺氧反硝化時所需要的C/N高;生物反應(yīng)器中反硝化菌群以蔗糖為碳源C/N為2.5亞硝酸鹽氮去除率最大達到5mg/L。有研究發(fā)現(xiàn),還原性的碳源越多,周質(zhì)硝酸鹽還原酶的活性越高;低C/N、NOR和N2OR等競爭力較弱的還原酶(其中N2OR最弱)活性就會受抑制。隨C/N降低,反硝化相關(guān)基因表達減弱,且無法獲得足夠的碳源合成足夠的反硝化酶系,影響了菌體的生長以及對硝酸鹽氮或亞硝酸鹽氮的去除;碳源受到限制時,好氧反硝化現(xiàn)象消失。2.4do閾值的比較多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi),反硝化率不受DO值的影響;當(dāng)DO降低到某個限值時,隨DO降低反應(yīng)效率迅速升高,說明DO存在一個閾值。Pseudomonasstuteri的硝酸鹽還原酶、亞硝酸還原酶和一氧化二氮還原酶的DO閾值分別是5.10、2.50、3.80mg/L。而Pseudomonasnautica三種還原酶的DO閾值分別是4.05、2.15、0.25mg/L。研究表明,閾值隨著底物、微生物的種類以及環(huán)境條件(溫度、氣壓、離子強度等)不同而不同,DO閾值的范圍一般在0.08—7.70mg/L。此外,Huang,etal.在利用Citrobacterdiversus進行好氧反硝化的研究時指出,ρ(DO)為2—6mg/L對細菌生長和反硝化最合適。2.5ph對rs表達的影響環(huán)境中的pH主要作用于細胞膜的電荷,影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝過程中酶的活性。?imek,etal.表示,細菌生長及反硝化酶活性的最適pH為中性或微堿性,而cnorB和nirS的表達水平在pH6—8可保持相對穩(wěn)定。Pseudomonasputida的亞硝酸鹽氮去除率于pH6—9時均較高;而Thioalkalivibrionitratireducen的亞硝酸鹽還原酶在pH6.7—7.5范圍內(nèi)活性最高,pH9—10會抑制其80%的活性,導(dǎo)致中間產(chǎn)物亞硝酸鹽氮、一氧化氮和一氧化二氮的積累。當(dāng)pH小于5.0時,生長及反硝化效能都急劇下降;pH為4.0時,細菌表面的負電荷環(huán)境被改變,營養(yǎng)物質(zhì)難于進入細胞,菌株的生長受阻,基質(zhì)中H+濃度過高,酶結(jié)構(gòu)不穩(wěn),硝酸還原酶活性遭到抑制,菌株生長和反硝化效能效果均最差。2.6鹽度對反硝化過程的影響細菌生長及反硝化活性最適溫度范圍是25—35℃,當(dāng)溫度超過這一范圍時,均會抑制細菌生長和反硝化性能。好氧反硝化過程對溫度的耐受性比較好,在17.5—33.1℃時,硝酸鹽氮平均去除率大于90%。有研究表明,Pseudomonasputida亞硝酸鹽去除率20—30℃時的顯著高于15℃。在低溫10—15℃時,由于菌株胞膜不飽和脂肪酸含量較高,保證了膜的通透性,仍具有一定的脫氮能力。高鹽度對反硝化還原酶活性有一定抑制作用。當(dāng)鹽度范圍在5—15時,細菌對亞硝酸鹽氮的去除率接近100%,當(dāng)鹽度超過15g/L,細菌亞硝酸鹽氮去除率逐漸降低。Dincer和Kargi研究表明當(dāng)NaCl濃度超過20g/L,硝酸鹽消耗和含氮化合物的脫除效率顯著減少。反硝化過程包含一些金屬離子為協(xié)作因子的蛋白質(zhì),因此,金屬對反硝化有顯著影響。添加Fe3+和Mo6+能增加NAR和NAP活性;Catarina,etal.研究發(fā)現(xiàn),60μg/gCu可抑制杜羅河沉淀物中85%反硝化過程;Cu的添加還可致使一氧化二氮和亞硝酸鹽氮的積累,顯著降低了nirK、nirS和nosZ的豐度和酶的多樣性。在適宜磁場條件下,磁作用使細胞內(nèi)線粒體數(shù)目和線粒體內(nèi)的嵴明顯增加,為細胞的呼吸、氧化還原提供足夠的