反硝化細(xì)菌的研究進(jìn)展

反硝化細(xì)菌的研究進(jìn)展

隨著世界經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，環(huán)境問題，尤其是水環(huán)境問題，日益嚴(yán)重。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)長期大量使用化肥,養(yǎng)殖水體積累了大量的魚類糞便和餌料殘?jiān)?導(dǎo)致水體氮素含量嚴(yán)重超標(biāo),形成水體氮污染,其中亞硝酸鹽能氧化魚蝦體內(nèi)的亞鐵血紅蛋白,使其成為高鐵血紅蛋白,喪失運(yùn)輸氧氣的能力,導(dǎo)致水生生物大批患病甚至死亡,嚴(yán)重影響水質(zhì)和水產(chǎn)品安全。近年來國內(nèi)外對(duì)氮污染的治理日益重視,目前微生態(tài)技術(shù)是當(dāng)前水環(huán)境污染治理的研究熱點(diǎn)。微生物的反硝化作用是地球氮素循環(huán)的重要分支,在水產(chǎn)養(yǎng)殖污染水體脫氮修復(fù)中起重要作用。其關(guān)鍵酶與細(xì)菌反硝化性能的強(qiáng)弱密切相關(guān),許多學(xué)者對(duì)反硝化細(xì)菌的各種反硝化酶進(jìn)行研究。本文從反硝化酶系和環(huán)境因子兩方面,對(duì)反硝化作用的影響進(jìn)行了系統(tǒng)論述,旨在為反硝化細(xì)菌在水體氮污染控制的深入研究提供理論基礎(chǔ)。1反硝化反應(yīng)反硝化作用又稱脫氮作用或硝酸鹽呼吸作用,即硝酸鹽或者亞硝酸鹽被還原成氣態(tài)氮化物(主要是N2,少量是N2O)的過程。反硝化過程主要包括如下四個(gè)反應(yīng):NO–3→NO2–→NO→N2O→N2。這四步反應(yīng)細(xì)菌分別利用硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶四種酶完成。1.1硫氰酸鹽nap細(xì)菌好氧反硝化的第一步是硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,由硝酸還原酶催化。反硝化菌通常包含一種或兩種硝酸還原酶,一種是膜結(jié)合硝酸還原酶(NAR),另一種為周質(zhì)硝酸還原酶(NAP)。NAR在厭氧條件下優(yōu)先表達(dá),且僅在厭氧狀態(tài)下發(fā)揮作用;NAP在有氧條件下優(yōu)先表達(dá),也存在于厭氧生長的細(xì)胞中,當(dāng)NAR被氧抑制時(shí),它仍具有硝酸還原能力。NARNAR是一個(gè)由3個(gè)亞基組成的復(fù)合物NarGHI,屬于鉬喋呤氧化還原酶家族。亞基NarI將酶固定到膜上,接受來自醌的電子,通過兩個(gè)亞鐵血紅素b將電子傳遞到NarH;NarH通過鐵硫鍵將電子傳遞到NarG胞質(zhì)一側(cè)的活性位點(diǎn)—鉬協(xié)作因子或核苷鉬輔因子;同時(shí)硝酸鹽在還原過程中形成NO2–和H2O,釋放到周質(zhì),電子傳遞到NarI=。氧氣以限制硝酸根通過細(xì)胞質(zhì)膜來間接抑制此酶的活性,使之在有氧條件下失活。NAR存在于Escherichiacoli、Pseudomonsdenitrificans、Bacilluslicheniformis、Bacillusstearothermophilus、Paracoccusdenitrification等微生物中。NAPNAP是由2個(gè)亞單位(NapA和NapB)組成的二聚體。大亞基NapA由基因napA編碼,為還原硝酸鹽的作用位點(diǎn),包含輔因子鉬蝶呤鳥苷二核苷酸(MGD)和一個(gè)鐵硫中心。NapB由基因napB編碼,為二血紅素細(xì)胞色素C552。鐵硫中心協(xié)助血紅素c和MGD之間的電子傳遞。NapC編碼一種四血紅素c型細(xì)胞色素,有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)雙血紅素,每個(gè)血紅素末梢都有一個(gè)組氨酸殘基。NapC在周質(zhì)中表達(dá),負(fù)責(zé)將電子從泛醌傳遞到NapAB。與NAR相比,NAP對(duì)硝酸根有更高的底物專一性,對(duì)疊氮化物的抑制不敏感;硫氰酸鹽可以競爭性地與NAP結(jié)合,是NAP的一種抑制劑。目前,一些細(xì)菌,如Haemophilusinfluenzae、Rhodobactersphaeroides、Pseudomonassp.和Sulfurimonasdenitrificans等編碼NAP的基因先后被鑒定。1.2維cu-nir基因在反硝化過程中,由亞硝酸還原酶(NIR)催化亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變成一氧化氮,實(shí)現(xiàn)了水體中的氮向大氣中氮的轉(zhuǎn)變,在反硝化過程中扮演了重要角色。NIR分布于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間,根據(jù)其輔基的不同一般分為由nirS編碼的血紅素cd1型亞硝酸還原酶(cd1-NiRs)和由nirK編碼的銅型亞硝酸還原酶(Cu-NiRs),它們分別以血紅素cd1和Cu作為輔基。通常由于反硝化NIR類型有排外性,NirK和NirS雖然等價(jià),生態(tài)位分化導(dǎo)致每個(gè)菌體只存在其中的一種。Cu-NiRCu-NiR是可溶性三角形酶,每個(gè)單體有兩個(gè)銅中心,Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型Cu為電子進(jìn)入位點(diǎn),主要的電子供體為天青蛋白和假天青蛋白,Ⅱ型Cu為底物結(jié)合位點(diǎn),受His100,His135和His306調(diào)控。電子從Ⅰ型Cu中心,通過Asp和His的化學(xué)途徑傳遞到Ⅱ型Cu中心,還原NO2–為NO。有研究證實(shí)Thiosphoerapanto-tropha、Bdellovibriobacteriovorus、Chromobacteriumviolaceum、Pseudoalteromonashaloplanktis和Bacillusazotoformans中都存在Cu-NiR。此外,一些Neisseria菌中存在另一種位于外部膜的亞硝酸鹽還原酶AniA,為Cu-NiR的同源體。cd1-NiRcd1-NiR是一種雙功能酶,催化NO2–得到一個(gè)電子轉(zhuǎn)變成NO,使O2得到4個(gè)電子生成水。細(xì)胞色素cd1-NiR為同二聚體周質(zhì)蛋白質(zhì),每個(gè)單體上含有兩個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán),c型和d1型。其電子供體為天青蛋白、細(xì)胞色素c551或假天青蛋白,電子通過c型血紅素傳遞到d1型血紅素,NO2–結(jié)合在d1血紅素上還原為NO(圖3)。研究表明,許多菌中都可分離到細(xì)胞色素cd1-NiR,包括Stenotrophomonasmaltophilia、Pseudomo-nasaeruginosa、Thiosphaerapantotropha、proteobacteria,Pseudomonasdenitrificans和Paracoccuspantotrophus。1.3金屬離子檢測(cè)一氧化氮還原酶(NOR)催化一氧化氮還原為一氧化二氮形成N-N鍵,該酶屬于亞鐵血紅素-銅氧化酶,根據(jù)其一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu),可分為三種:cNor、qNor和qCuNor。cNorcNor為膜結(jié)合細(xì)胞色素bc型酶,也稱短鏈Nor(scNor),由cnorB基因編碼,包含一個(gè)小亞基NorC和一個(gè)大亞基NorB。NorC固定于質(zhì)膜,包含一個(gè)亞鐵血紅素c,配合一個(gè)保守組氨酸和一個(gè)蛋氨酸,將電子傳遞到催化單元NorB。NorB為一膜錨定蛋白,包含兩個(gè)亞鐵血紅素b和一個(gè)非亞鐵血紅素鐵。其中一個(gè)亞鐵血紅素b,配合兩個(gè)保守組氨酸,將電子轉(zhuǎn)移到二金屬雙核催化反應(yīng)中心,釋放N2O到周質(zhì)。在亞鐵細(xì)胞色素c作為電子供體的條件下,此酶顯示出很高的一氧化氮還原酶活性。研究發(fā)現(xiàn)cnorB基因類型的菌有Pseudomonasaeruginosa、Pseudomonassrutzeri、Paracoccusdenitrfican、Halomonashalodenitrficans、Rhodobactersphaerroides、Bradyrhizobiumjaponicum和Alcaligenesfaecalis。qNor在Ralstoniaeutropha中發(fā)現(xiàn)另一種一氧化氮還原酶qNor,也稱NorZ或長鏈Nor(lcNor)。該酶是單體酶,由qnorB基因編碼。qNor多肽鏈與cNor有很高的同源性,由一個(gè)N端延伸和一個(gè)C端域組成。其N端為對(duì)苯二酚結(jié)合位點(diǎn),C端類似于cNor酶的催化亞基NorB。該酶在反硝化和非反硝化細(xì)菌中都有,而后者經(jīng)常有致病性。Hendriks,etal.研究表明含有qNor酶的菌主要有Staphylococcusaureus、Bacillusstearother-mophilus、Mycobacteriumavium、Corynebacteriumdiph-theriae、Synechocystissp.和Ralstoniaeutropha。qCuANor革蘭氏陽性菌中存在第三種類型的一氧化氮還原酶qCuANor。該酶含有兩個(gè)亞基,最大的催化亞基類似NorB,含有兩個(gè)亞鐵血紅素b,小亞基利用CuA位點(diǎn)獲得電子傳遞到催化亞基。該酶利用延胡索酸和細(xì)胞色素c551為電子供體,前者作用于一氧化氮脫毒作用,后者作用于反硝化。qCuANor僅在Bacillusazotofor-mans中,而其編碼基因尚未發(fā)現(xiàn)。1.4urple型二聚體酶一氧化二氮還原生成氮?dú)?為完全反硝化的最終步驟,催化該反應(yīng)的一氧化二氮還原酶(N2OR),為多銅二聚體酶,由nosZ基因編碼其催化中心。在革蘭氏陰性菌中為周質(zhì)酶,革蘭氏陽性菌中為膜結(jié)合酶。好氧與厭氧反硝化菌中分離出的N2OR在分子性質(zhì)上非常相似。根據(jù)氧化還原特性和光譜學(xué)分析,可分為Ⅰ型(purple型)和Ⅱ型(pink型),其中Ⅱ型是從有氧狀態(tài)下的培養(yǎng)物中分離而來。該同型二聚體酶每個(gè)亞基都包含6個(gè)Cu原子,它們排列成2個(gè)不同類型的多聚銅活性中心,一個(gè)是雙核電子傳遞位點(diǎn)CuA;另一個(gè)是四核催化位點(diǎn)CuZ。CuA從細(xì)胞色素c、延胡索酸或假天青素得到電子,傳遞到亞基CuZ,在此N2O還原成N2。N2OR從Pseudomonasstutzeri首次分離得到,其后陸續(xù)在其他菌中發(fā)現(xiàn):Pseudomonasstutzeri、Rhodobactercapsulatus、Wolinellasuccinogenes、Achromobactercyclo-clastes、Pseudomonasaeruginosa、Paracoccuspantotro-phus、Alcaligenesxylosoxidans、Pseudomonasnautica等。通常攜帶nirS的菌也帶有nosZ,極少例外,而攜帶nirK的菌更多使用不完全反硝化途徑,推測(cè)與其進(jìn)化機(jī)制有關(guān)。2環(huán)境要素的定義對(duì)微生物生長發(fā)育具有直接或間接影響的環(huán)境要素,被稱為環(huán)境因子。環(huán)境因子如電子受體、碳源、碳氮比、溶解氧、pH和溫度等,為反硝化的重要影響因素。2.1電子受體的結(jié)構(gòu)作為電子受體,硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮是控制反硝化效率的最直接因素。在Verbaenderta,etal.的研究中,70.5%反硝化菌以硝酸鹽為電子受體,45.5%以亞硝酸鹽為電子受體,18.2%該兩種電子受體都能利用,95.5%能以兩者的復(fù)合物為電子受體。Paracoccuspantotrophus以氧和硝酸鹽共同作為電子受體時(shí)其生長速率高于以單一底物作為電子受體時(shí)的速率,最后獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)率也最高,缺少NO–3或O2都會(huì)降低細(xì)菌的生長率和反硝化率。有研究表明,NO–3濃度越高,Pseudomonasmandelii反硝化基因表達(dá)更持久。2.2不同溶劑對(duì)氧反硝化菌群落的影響反硝化菌以有機(jī)碳為主要電子供體,碳源含量為影響好氧反硝化的主要因素。Bernat,etal.利用活性污泥處理無碳源的合成廢水時(shí)脫氮率為1.54mg[N]/L,而處理投加醋酸鈉的配制廢水時(shí)脫氮率達(dá)到22.50mg[N]/L,說明好氧反硝化菌外源呼吸比內(nèi)源呼吸效率高。在對(duì)群落和碳源關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn),醋酸對(duì)污水處理廠發(fā)現(xiàn)的反硝化菌Thauera和Acidovorax具有選擇作用;乙醇或甲醇可以誘導(dǎo)出獨(dú)特的反硝化群落,而且對(duì)cd1-NiR反硝化菌影響更大。在乙酸鈉和丁二酸鈉為碳源時(shí),反硝化菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率最高,而對(duì)乳酸、蔗糖的碳源利用率較低,亞硝酸鹽氮去除率相對(duì)較小,可見菌對(duì)小分子碳源的利用率較高,而對(duì)大分子碳源的利用率較低。2.3生物反應(yīng)器中反硝化菌群C/N在反硝化過程中同樣也起著很重要的作用,脫氮率隨C/N的提高而增加。Citrohucterdiversus以醋酸為碳源且C/N為4—5時(shí)可得到最佳的反硝化活性,該C/N較缺氧反硝化時(shí)所需要的C/N高;生物反應(yīng)器中反硝化菌群以蔗糖為碳源C/N為2.5亞硝酸鹽氮去除率最大達(dá)到5mg/L。有研究發(fā)現(xiàn),還原性的碳源越多,周質(zhì)硝酸鹽還原酶的活性越高;低C/N、NOR和N2OR等競爭力較弱的還原酶(其中N2OR最弱)活性就會(huì)受抑制。隨C/N降低,反硝化相關(guān)基因表達(dá)減弱,且無法獲得足夠的碳源合成足夠的反硝化酶系,影響了菌體的生長以及對(duì)硝酸鹽氮或亞硝酸鹽氮的去除;碳源受到限制時(shí),好氧反硝化現(xiàn)象消失。2.4do閾值的比較多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi),反硝化率不受DO值的影響;當(dāng)DO降低到某個(gè)限值時(shí),隨DO降低反應(yīng)效率迅速升高,說明DO存在一個(gè)閾值。Pseudomonasstuteri的硝酸鹽還原酶、亞硝酸還原酶和一氧化二氮還原酶的DO閾值分別是5.10、2.50、3.80mg/L。而Pseudomonasnautica三種還原酶的DO閾值分別是4.05、2.15、0.25mg/L。研究表明,閾值隨著底物、微生物的種類以及環(huán)境條件(溫度、氣壓、離子強(qiáng)度等)不同而不同,DO閾值的范圍一般在0.08—7.70mg/L。此外,Huang,etal.在利用Citrobacterdiversus進(jìn)行好氧反硝化的研究時(shí)指出,ρ(DO)為2—6mg/L對(duì)細(xì)菌生長和反硝化最合適。2.5ph對(duì)rs表達(dá)的影響環(huán)境中的pH主要作用于細(xì)胞膜的電荷,影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝過程中酶的活性。?imek,etal.表示,細(xì)菌生長及反硝化酶活性的最適pH為中性或微堿性,而cnorB和nirS的表達(dá)水平在pH6—8可保持相對(duì)穩(wěn)定。Pseudomonasputida的亞硝酸鹽氮去除率于pH6—9時(shí)均較高;而Thioalkalivibrionitratireducen的亞硝酸鹽還原酶在pH6.7—7.5范圍內(nèi)活性最高,pH9—10會(huì)抑制其80%的活性,導(dǎo)致中間產(chǎn)物亞硝酸鹽氮、一氧化氮和一氧化二氮的積累。當(dāng)pH小于5.0時(shí),生長及反硝化效能都急劇下降;pH為4.0時(shí),細(xì)菌表面的負(fù)電荷環(huán)境被改變,營養(yǎng)物質(zhì)難于進(jìn)入細(xì)胞,菌株的生長受阻,基質(zhì)中H+濃度過高,酶結(jié)構(gòu)不穩(wěn),硝酸還原酶活性遭到抑制,菌株生長和反硝化效能效果均最差。2.6鹽度對(duì)反硝化過程的影響細(xì)菌生長及反硝化活性最適溫度范圍是25—35℃,當(dāng)溫度超過這一范圍時(shí),均會(huì)抑制細(xì)菌生長和反硝化性能。好氧反硝化過程對(duì)溫度的耐受性比較好,在17.5—33.1℃時(shí),硝酸鹽氮平均去除率大于90%。有研究表明,Pseudomonasputida亞硝酸鹽去除率20—30℃時(shí)的顯著高于15℃。在低溫10—15℃時(shí),由于菌株胞膜不飽和脂肪酸含量較高,保證了膜的通透性,仍具有一定的脫氮能力。高鹽度對(duì)反硝化還原酶活性有一定抑制作用。當(dāng)鹽度范圍在5—15時(shí),細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率接近100%,當(dāng)鹽度超過15g/L,細(xì)菌亞硝酸鹽氮去除率逐漸降低。Dincer和Kargi研究表明當(dāng)NaCl濃度超過20g/L,硝酸鹽消耗和含氮化合物的脫除效率顯著減少。反硝化過程包含一些金屬離子為協(xié)作因子的蛋白質(zhì),因此,金屬對(duì)反硝化有顯著影響。添加Fe3+和Mo6+能增加NAR和NAP活性;Catarina,etal.研究發(fā)現(xiàn),60μg/gCu可抑制杜羅河沉淀物中85%反硝化過程;Cu的添加還可致使一氧化二氮和亞硝酸鹽氮的積累,顯著降低了nirK、nirS和nosZ的豐度和酶的多樣性。在適宜磁場(chǎng)條件下,磁作用使細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目和線粒體內(nèi)的嵴明顯增加,為細(xì)胞的呼吸、氧化還原提供足夠的