基于quechers技術(shù)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理技術(shù)

基于quechers技術(shù)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理技術(shù)

農(nóng)業(yè)中殘留農(nóng)藥的分析是檢測(cè)農(nóng)業(yè)質(zhì)量安全的主要內(nèi)容。加強(qiáng)對(duì)農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)和環(huán)境毒理研究,對(duì)于合理開發(fā)和正確使用化學(xué)農(nóng)藥,保護(hù)生態(tài)環(huán)境,保障人類健康,避免和減少不必要的農(nóng)業(yè)損失和國(guó)際貿(mào)易爭(zhēng)端等具有重要的理論和實(shí)踐意義。近年來,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)、超臨界流體色譜(SPC)、毛細(xì)管電泳色譜(CE)和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等分析技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前主要的農(nóng)藥殘留分析技術(shù)?，F(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)對(duì)樣品的前處理提出了更高的要求,因此,快速、準(zhǔn)確、安全、高效的樣品前處理新技術(shù)的開發(fā)需求也日益迫切。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于實(shí)際操作的前處理方法有固相萃取(solid-phaseextraction,SPE)、固相微萃取(solid-phasemicroextraction,SPME)、凝膠滲透色譜(gelpermeationchromatography,GPC)、超臨界流體萃取(supercriticafluidextraction,SFE)、加速溶劑萃取(acceleratedsolventextraction,ASE)、微波輔助萃取(microwave-assistedextraction,MAE)、基質(zhì)固相分散(matrixsolid-phasedispersion,MSPD)等。但這些方法均很難同時(shí)對(duì)絕大多數(shù)農(nóng)藥達(dá)到較高質(zhì)量的提取分析。2003年,美國(guó)農(nóng)業(yè)部Anastassiades教授等開發(fā)了一種新的樣品前處理技術(shù)——QuEChERS方法,較好地解決了這個(gè)問題。自QuEChERS方法出現(xiàn)以來,引起了農(nóng)殘工作者的普遍關(guān)注,也逐漸對(duì)它進(jìn)行了方法改進(jìn),使其在各領(lǐng)域樣品前處理中的應(yīng)用日益廣泛。1quehens方法QuEChERS方法是近年來國(guó)際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)。因其具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠、安全的特點(diǎn)而得名QuEChERS方法,此技術(shù)一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就吸引了大量農(nóng)殘研究者的目光。其原理與高效液相色譜(HPLC)和固相萃取(SPE)相似,都是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用,吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),乙腈為最適合萃取寬范圍極性農(nóng)藥多殘留物的溶劑,可用于色質(zhì)聯(lián)用分析;無(wú)水MgSO4吸水的同時(shí)也產(chǎn)熱,使萃取液的溫度更適合農(nóng)藥的萃取;離心促使提取液與混濁的樣品分層;再次加入無(wú)水MgSO4為吸取多余的水分;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附劑能夠清除許多極性基質(zhì)成份如來自樣品共萃取物的脂肪酸、某些極性親脂性色素和糖類等,而對(duì)農(nóng)藥殘留物無(wú)吸附作用。隨后的研究進(jìn)一步證實(shí)有超過200種農(nóng)藥可用此法分析,其中包括含脂肪的介質(zhì)體系。其技術(shù)核心是在農(nóng)作物(水果、蔬菜等)的提取液中直接加入除水劑和雜質(zhì)吸附劑,提取液經(jīng)離心之后直接進(jìn)行色質(zhì)聯(lián)用分析。由于不需經(jīng)過傳統(tǒng)前處理的提取液濃縮干燥、過固相萃取柱凈化等步驟,所以這是一種省時(shí)、經(jīng)濟(jì)和適用面廣的新技術(shù)。最近QuEChERS方法已經(jīng)被做為AOAC的標(biāo)準(zhǔn)方法用于水果和蔬菜的農(nóng)殘檢測(cè)中。QuEChERS方法的步驟可以簡(jiǎn)單歸納為:(1)樣品粉碎;(2)單一溶劑乙腈提取分離;(3)加入MgSO4等鹽類除水;(4)加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等吸附劑除雜;(5)上清液進(jìn)行GC-MS、LC-MS檢測(cè)。與傳統(tǒng)的SPE等前處理方法相比,QuEChERS方法有以下優(yōu)勢(shì):(1)回收率高,對(duì)大量極性及揮發(fā)性的農(nóng)藥品種的回收率大于85%;(2)精確度和準(zhǔn)確度高,可用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正;(3)可分析的農(nóng)藥范圍廣,包括極性、非極性的農(nóng)藥種類均能利用此技術(shù)得到較好的回收率;(4)分析速度快,能在30min內(nèi)完成6個(gè)樣品的處理;(5)溶劑使用量少,污染小,價(jià)格低廉且不使用含氯化物溶劑;(6)操作簡(jiǎn)便,無(wú)需良好訓(xùn)練和較高技能便可很好地完成;(7)乙腈加到容器后立即密封,使其與工作人員的接觸機(jī)會(huì)減少;(8)樣品制備過程中使用很少的玻璃器皿,裝置簡(jiǎn)單。2que齋在食品中檢測(cè)農(nóng)藥殘留的應(yīng)用2.1quech在水果、蔬菜和農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用研究2.1.1quehens檢測(cè)方法QuEChERS方法作為一種標(biāo)準(zhǔn)方法被開發(fā)是首先應(yīng)用于果蔬當(dāng)中,所以目前QuEChERS較為成熟的應(yīng)用仍是在果蔬等含水量較大的基質(zhì)中。但已有部分實(shí)驗(yàn)室開始嘗試用于其他農(nóng)產(chǎn)品和水產(chǎn)品的農(nóng)殘藥殘分析,并取得了一些成果。國(guó)內(nèi)近年才引進(jìn)此方法,并由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)了用于水果蔬菜中農(nóng)殘檢測(cè)的第一個(gè)農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)——NY/T1380—2007。國(guó)外對(duì)QuEChERS方法較早的研究中,多以單一的PSA為除雜劑,檢測(cè)的農(nóng)藥種類也以氨基甲酸酯類等少數(shù)幾種農(nóng)藥為主,分析多以GC、HPLC、GC-MS進(jìn)行。2005年,Lehotay等在萵苣和橘子樣品中加入229種10~100ng/g農(nóng)藥混標(biāo)后,取15ml加標(biāo)樣品,加入6g無(wú)水MgSO4和1.5gNaCl,取出上清液加入1.8g無(wú)水MgSO4和300mgPSA,經(jīng)GC/LC-MS檢測(cè),回收率在70%~120%(其中206種農(nóng)藥回收率達(dá)90%~110%),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。同時(shí),另一組實(shí)驗(yàn)中,嘗試了加入1%的乙酸緩沖劑,凈化時(shí)每毫升萃取液加入150mg無(wú)水MgSO4和50mgPSA,確?；|(zhì)pH在4~5之間,最大程度的降低堿性敏感的農(nóng)藥殘留物的降解,結(jié)果表明,堿性敏感農(nóng)藥:滅菌丹(folpet)、抑菌靈(dichlofluani)、百菌清(chlorothaloni)、吡嗪酮(pymetrozine)等回收率達(dá)到95%±5%以上?？梢娂尤刖彌_劑有利于堿敏感農(nóng)藥的回收。2.1.2本方法的回收率和精密度隨后的諸多研究依據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)在緩沖溶液的使用、除雜劑的選擇等方面有了很大的進(jìn)步,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度也有較大提高。2007年,Payá等在黃瓜、檸檬、柑橘樣品中,運(yùn)用改良的QuEChERS方法,在第一步提取時(shí),添加檸檬酸鈉和檸檬酸二鈉作為緩沖保護(hù)劑,在酸性較強(qiáng)的檸檬中額外加入600μl的NaOH來調(diào)節(jié)pH值。在離心后的每毫升提取液中加入150mgMgSO4、25mgPSA,提取液中加入10μl5%甲酸進(jìn)行再酸化,然后分別進(jìn)行GC-MS/MS、LC-MS/MS分析。檢測(cè)限為0.01~0.1mg/kg,平均回收率為70%~110%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%。此結(jié)果證明,加入檸檬酸鹽,建立緩沖體系對(duì)某些對(duì)酸堿敏感的農(nóng)藥的分離有良好的作用。Garrido等開發(fā)了一種極為簡(jiǎn)單的QuEChERS方法即在非脂肪體系的粉碎樣品中,直接加入1%乙酸的乙腈提取,再加入4g無(wú)水MgSO4和1g醋酸銨振蕩離心后上清液直接裝瓶進(jìn)UPLC-MS/MS檢測(cè);對(duì)脂肪體系的樣品,則在離心后過佛羅里硅土固相萃取柱凈化后上機(jī)檢測(cè)。醋酸銨是構(gòu)成酸性緩沖體系的物質(zhì),對(duì)于維持溶液的pH值,防止對(duì)堿敏感農(nóng)藥的降解。國(guó)內(nèi)對(duì)QuEChERS方法較早的研究中,也多以單一的PSA為除雜劑,檢測(cè)的農(nóng)藥種類也以氨基甲酸酯類等少數(shù)幾種農(nóng)藥為主,分析多以GC、HPLC、GC-MS進(jìn)行。而在LC-MS、LC-MS/MS等液質(zhì)聯(lián)用方面的研究比較少。2005年,沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)和天津市大港區(qū)農(nóng)林畜牧局合作研究了果蔬中35種有機(jī)磷和有機(jī)氯的農(nóng)藥殘留檢測(cè),研究以乙腈為提取溶劑,PSA和無(wú)水MgSO4進(jìn)行分散固相萃取(Disperse-SPE),GC-MS檢測(cè)、方法的加標(biāo)回收率在70%~110%之間,取得了很好的提取凈化效果。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的潘燦平工作組是國(guó)內(nèi)較早引進(jìn)QuEChERS方法檢測(cè)農(nóng)藥殘留的,2005~2006年,該工作組用QuEChERS測(cè)定了枸杞中的包括菊酯類在內(nèi)的12種農(nóng)藥以及吡蟲啉、阿維菌素的殘留。對(duì)于枸杞這種糖類、色素含量較高的樣品,亦取得了較好的效果。2.1.3改良型的quehens方法除了建立緩沖體系,研究人員還在吸附劑地選擇上有所創(chuàng)新,單純的吸附劑PSA也陸續(xù)與其他的吸附劑相配合,以適合更多成分復(fù)雜的樣品,達(dá)到更好地除雜效果。國(guó)外對(duì)QuEChERS前處理,色質(zhì)聯(lián)用分析檢測(cè)農(nóng)藥殘留的研究中,更注重對(duì)色譜、質(zhì)譜條件的改進(jìn),對(duì)QuEChERS的改良多體現(xiàn)在緩沖溶液的使用上,對(duì)吸附劑選擇上改良并不多。例如Antonio、Nguyen、Banerjee等在QuEChERS做前處理時(shí),使用的都是沒經(jīng)過改良的QuEChERS方法,即乙腈提取,PSA、無(wú)水MgSO4除雜。但也有人在嘗試添加ODSC18、GCB等改善提取效果。國(guó)內(nèi)在新型吸附劑地選擇方面發(fā)展很快。董靜等在改良型的QuEChERS方法研究上做出了很多成就,在用0.1%冰醋酸-乙腈溶液提取后,凈化時(shí),除PSA外,額外加入ODSC18粉、石墨化炭黑(GCB)、氨丙基粉等吸附劑,PSA去除脂肪酸效果較好,去除色素、維生素的效果一般,而ODSC18粉、石墨化炭黑(GCB)除色素、維生素的能力較好,這種混合型的分散固相萃取可以明顯改善凈化效果。用改良型的方法用于果蔬中包括有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類在內(nèi)的54種農(nóng)藥的檢測(cè),檢出限在3~25μg/kg之間,在添加含量0.05~1.0mg/kg范圍內(nèi)回收率在60%~120%之間,標(biāo)準(zhǔn)偏差在4%~14%,達(dá)到了農(nóng)殘檢測(cè)的要求。邵華等用石墨化碳分散固相萃取GC-MS法測(cè)定蔬菜中的48種農(nóng)藥多殘留,內(nèi)標(biāo)法定量,利用GCB去除色素,在GCB的用量、GCB加入的時(shí)間方面進(jìn)行研究,確定了20g樣品中,加入GCB的量在0.5g為宜,且在均質(zhì)后的提取液中加入效果較好。并且通過濃縮,大大降低了樣品的檢出限,滿足了最低檢出量(LODs)小于最大殘留限量(MRLs)的要求。在緩沖溶液和吸附劑的選擇方面所做的改良都為更好地提取和凈化創(chuàng)造了條件,也使處理的樣品能滿足更多種檢測(cè)器的需要。2.2提取溶劑的選擇及萃取方式對(duì)樣品殘留的影響糧谷不同于水果蔬菜,含水量很小,而QuEChERS最初是對(duì)含水量大于75%的樣品所設(shè)計(jì),對(duì)于糧谷這種干燥的樣品,在處理時(shí)加入一定量的水,普遍采用的仍是乙腈提取,PSA、MgSO4凈化。Diez等應(yīng)用改進(jìn)型QuEChERS處理磨碎的大麥樣品,2.5g樣品加入7.5g水,再用10ml乙腈提取,4gMgSO4、1gNaCl、25mgPSA等凈化。并同時(shí)與LUKE法和乙酸乙酯提取的前處理結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,并分別用GC-TOF/MS和LC-MS/MS檢測(cè)得到的前處理樣品。結(jié)果表明,QuEChERS的基質(zhì)效應(yīng)最小,線性最好。并不是所有的干燥的樣品都要加水,在不加水時(shí),可以直接用乙腈萃取沈菁等就以乙腈為萃取溶劑浸泡過夜,PSA、MgSO4凈化,實(shí)現(xiàn)樣品快速制備。液相色譜電噴霧質(zhì)譜定量檢測(cè)大米中呋喃丹的殘留量。加標(biāo)回收率和RSD值,均符合農(nóng)藥殘留的分析要求。以上研究更加驗(yàn)證了QuEChERS做為一種新技術(shù),在對(duì)干燥樣品的處理上也是可行的,具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。2.3凈化條件的確定以上的研究多集中于植物性食品,在對(duì)動(dòng)物組織,如肌肉組織中獸藥殘留的研究方面,QuEChERS也發(fā)揮了一定的作用。董靜工作組建立了一種QuEChERS-HPLC法檢測(cè)動(dòng)物組織中克球酚、地克珠利和磺胺類藥物殘留量。由于動(dòng)物組織的特殊性,該研究是用14ml乙腈與氯仿為10:1的混合溶液代替乙腈,并加入10ml10%硫酸鈉溶液來提取,依據(jù)基質(zhì)情況差異添加ODSC18粉末、PSA粉末、氧化鋁粉來凈化。原QuEChERS方法用PSA去除果蔬中的脂肪酸、色素,而動(dòng)物組織中含有大量蛋白和脂肪,所以凈化過程中同時(shí)考慮使用ODSC18粉和中性氧化鋁粉,采用混合型分散固相萃取凈化,各種吸附劑粉末的用量也針對(duì)不同的樣品基質(zhì)進(jìn)行調(diào)整。7種化合物檢測(cè)限至少能分別達(dá)到:克球酚0.05mg/kg、磺胺類0.05mg/kg、地克珠利0.1mg/kg。在添加回收率實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)添加水平在0.1~1.0mg/kg范圍內(nèi),回收率均可在65%~100%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1%~10%之間。由此可見,QuEChERS不僅可以處理植物中的糖類、脂肪酸、色素等,對(duì)動(dòng)物性食品中的蛋白和脂肪的凈化也有不錯(cuò)的效果。2.4分離提取的檢測(cè)牛奶中含有大量的水分、蛋白質(zhì)和脂肪,這些大分子物質(zhì)對(duì)色譜系統(tǒng)造成干擾,嚴(yán)重影響色譜柱的壽命。以往的前處理方法多為液液萃取、SPE凈化,此法耗時(shí)、花費(fèi)高。西班牙的Aguilera-Luiz開發(fā)了一種改良型QuEChERS-UPLC-MS/MS法測(cè)定3種牛奶(全脂、半脫脂、脫脂)中18種獸用抗生素殘留的方法。用含1%乙酸的乙腈和0.1mol/LNa2EDTA提取,無(wú)水MgSO4和CH3COONa凈化,過濾稀釋后直接進(jìn)UPLC-MS/MS檢測(cè),結(jié)果顯示,最低檢出限(LOD)為1~4μg/kg,加標(biāo)回收率為70%~110%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于21%,適合于牛奶中常見抗生素的快速準(zhǔn)確定量、定性分析。對(duì)蜂蜜這樣黏稠、含水量小的樣品而言,前處理亦是一個(gè)難點(diǎn)。蜂蜜中的糖類和有機(jī)色素等極性干擾物會(huì)對(duì)農(nóng)藥的提取產(chǎn)生很大的干擾。初級(jí)次級(jí)胺(PSA)可以有效的吸附這些干擾物質(zhì)。陳舒舒等建立了反相高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜法檢測(cè)蜂蜜中氯霉素殘留的方法。前處理采用改良的QuEChERS方法進(jìn)行快速提取和凈化,采用PSA進(jìn)行固相分散凈化,可有效吸附蜂蜜中的糖類及有機(jī)色素等雜質(zhì)。用電噴霧電離法(ESI)負(fù)離子模式、多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)對(duì)氯霉素進(jìn)行定性定量分析。在0.2~200μg/kg的添加濃度下,添加回收率水平在78%~93%間,變異系數(shù)在3.9%以下。表明該法適用于動(dòng)物性產(chǎn)品中氯霉素的快速定性、定量檢測(cè)。2.5