高效液相色譜法講義（包含講義和試驗(yàn)）

本文格式為Word版，下載可任意編輯——高效液相色譜法講義（包含講義和試驗(yàn)）高效液相色譜儀在基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)試驗(yàn)產(chǎn)物分析中的應(yīng)用

第一部分：基礎(chǔ)理論部分

一、色譜法簡(jiǎn)介1.色譜法簡(jiǎn)史

1906年俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（Tswett）首次提出“色譜法〞（Chromatography）的概念。他在論文中寫(xiě)到：“（原文）植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端參與，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結(jié)果依照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀(guān)測(cè)到它們相應(yīng)的色帶，就像光譜一樣，稱(chēng)之為色譜圖。〞2.色譜法分類(lèi)

色譜過(guò)程的本質(zhì)是待分開(kāi)物質(zhì)分子在固定相和滾動(dòng)相之間分派平衡的過(guò)程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分派會(huì)不同，這使其隨滾動(dòng)相運(yùn)動(dòng)速度各不一致，隨著滾動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)，混合物中的不同組分在固定相上相互分開(kāi)。根據(jù)物質(zhì)的分開(kāi)機(jī)制的不同，又可以分為吸附色譜、分派色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜等類(lèi)別。（1）吸附色譜

吸附色譜利用固定相吸附中心對(duì)物質(zhì)分子吸附能力的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物的分開(kāi)，吸附色譜的色譜過(guò)程是滾動(dòng)相分子與物質(zhì)分子競(jìng)爭(zhēng)固定相吸附中心的過(guò)程。（2）分派色譜

分派色譜是利用固定相與滾動(dòng)相之間對(duì)待分開(kāi)組分溶解度的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分開(kāi)。分派色譜的固定相一般為液相的溶劑，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者擔(dān)體表面。分派色譜的色譜過(guò)程本質(zhì)上是組分分子在固定想和滾動(dòng)相之間不斷達(dá)到溶解平衡的過(guò)程。（3）離子交換色譜

離子交換色譜利用被分開(kāi)組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來(lái)實(shí)

現(xiàn)分開(kāi)。離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂分子結(jié)構(gòu)中存在大量可以電離的活性中心，待分開(kāi)組分中的離子會(huì)與這些活性中心發(fā)生離子交換，形成離子交換平衡，從而在滾動(dòng)相與固定相之間形成分派。固定相的固有離子與待分開(kāi)組分中的離子之間相互爭(zhēng)奪固定相中的離子交換中心，并隨著滾動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)而運(yùn)動(dòng)，最終實(shí)現(xiàn)分開(kāi)。（4）凝膠色譜

凝膠色譜的原理比較特別，類(lèi)似于分子篩。待分開(kāi)組分在進(jìn)入凝膠色譜后，會(huì)依據(jù)分子量的不同，進(jìn)入或者不進(jìn)入固定相凝膠的孔隙中，不能進(jìn)入凝膠孔隙的分子會(huì)很快隨滾動(dòng)相洗脫，而能夠進(jìn)入凝膠孔隙的分子則需要更長(zhǎng)時(shí)間的沖洗才能夠流出固定相，從而實(shí)現(xiàn)了根據(jù)分子量差異對(duì)各組分的分開(kāi)。調(diào)整固定相使用的凝膠的交聯(lián)度可以調(diào)整凝膠孔隙的大小;改變滾動(dòng)相的溶劑組成會(huì)改變固定相凝膠的溶漲狀態(tài)，進(jìn)而改變孔隙的大小，獲得不同的分開(kāi)效果。二、高效液相色譜法簡(jiǎn)介1.高效液相色譜發(fā)展背景

液相色譜法發(fā)展初期是用大直徑的玻璃管柱在室溫柔常壓下用液位差輸送滾動(dòng)相，稱(chēng)為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)（常有幾個(gè)小時(shí)）。高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送滾動(dòng)相，故又稱(chēng)高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱(chēng)為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也稱(chēng)現(xiàn)代液相色譜。一句話(huà)，高效液相色譜是以高柱效小顆粒填料為載體，以高壓泵為滾動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行快速分開(kāi)和分析的方法。

2.高效液相色譜的特點(diǎn)

高效液相色譜的“高效〞主要表達(dá)在以下“四高〞：

（1）高壓

滾動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必需對(duì)載液加高壓。（2）高速

分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，尋常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。（3）高效

分開(kāi)效能高?？蛇x擇固定相和滾動(dòng)相以達(dá)到最正確分開(kāi)效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分開(kāi)效能高出大量倍。（4）高靈敏度

紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在μL數(shù)量級(jí)。三、高效液相色譜的組成

1.系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖（以安捷倫1220為例）

如上圖所示，高效液相色譜主要有儲(chǔ)液瓶、高壓泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和色譜工作站組成。

2.儲(chǔ)液瓶和脫氣機(jī)

主要用于存儲(chǔ)滾動(dòng)相（溶劑或緩沖液）和除去滾動(dòng)相中的氣泡。

滾動(dòng)相進(jìn)入高壓泵之前必需脫氣（脫氣機(jī)一般包含在高壓泵組件中），特別是水和極性溶劑。否則氣泡進(jìn)入色譜柱以后，將影響分開(kāi)效率、基線(xiàn)不穩(wěn)使檢測(cè)器靈敏度降低，甚至不能正常工作。3.高壓泵

色譜柱用細(xì)粒填料，填充緊湊，液體滾動(dòng)相粘度高，阻力大，必需高壓輸液。高壓泵是高效液相色譜的關(guān)鍵部件，直接影響整個(gè)儀器和分析結(jié)果的可靠性。

高壓泵分為兩類(lèi)：恒流泵和恒壓泵。恒流泵：柱阻力變化，滾動(dòng)相粘度變化，引起柱壓變化而流量恒定，如往復(fù)柱塞泵。恒壓泵：流量可隨外界阻力變化而輸出壓力恒定，例如裝柱用的氣動(dòng)泵。HPLC廣泛采用往復(fù)柱塞泵，由液缸，柱塞，單向閥和驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)組成。密封圈耐磨（PTF-石墨）單向閥，柱塞為人造紅寶石。

泵流量不穩(wěn)將影響化合物的保存時(shí)間，直接影響峰面積重現(xiàn)性和定量精度，使噪音變大，最小檢測(cè)量變大。雙柱塞泵流量平穩(wěn)，輸液精度高，流量精量+/-0.1%，流量確鑿度+/-1%。雙柱塞泵液缸容積很小（幾微升~幾百微升）適于梯度洗脫。為提供無(wú)脈動(dòng)的確鑿流量，在輸液系統(tǒng)中還需加一些輔助設(shè)備：過(guò)濾器、混合器、阻尼器，測(cè)壓裝置。多元混合溶劑需用比例閥，如二元、三元和四元比例閥。溶劑按預(yù)定比例，低壓混合后，經(jīng)高壓泵輸入系統(tǒng)。4.進(jìn)樣系統(tǒng)

HPLC采用六通閥進(jìn)樣，重現(xiàn)性好，操作便利，易于自動(dòng)化，大大提高了分析精度。

注射器進(jìn)樣：絕對(duì)誤差在5%左右，相對(duì)誤差在1%。

閥進(jìn)樣：誤差均在1%以?xún)?nèi)。進(jìn)樣量由定體積定量管和平頭微量注射器控制，注射器體積應(yīng)為定量管體積的2~3倍。HPLC柱可注入較大體積的稀溶液，進(jìn)樣體積在10~250ul。

對(duì)于多樣品的連續(xù)分析，可以采用自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)；該系統(tǒng)可以在軟件的控制下，自動(dòng)逐個(gè)進(jìn)樣。

5.色譜柱

色譜柱是色譜儀最重要的部件。尋常用厚壁玻璃管或內(nèi)壁拋光的不銹鋼管制作的，對(duì)于一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時(shí)，可用銅管、鋁管或聚四氟乙烯管。柱子內(nèi)徑一般為1～6mm。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為4.6或3.9mm，長(zhǎng)度為15～30cm的直形不銹鋼柱。填料顆粒度5～10μm，柱效以理論塔板數(shù)計(jì)大約7000～10000。色譜柱的發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

填料的類(lèi)型決定了色譜柱的用途。液相色譜柱的分開(kāi)作用是在填料與滾動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類(lèi)是依據(jù)填料類(lèi)型而定。

正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10μm的范圍內(nèi)。另一類(lèi)正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。

反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。

常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10μm之間。6.檢測(cè)器

高效液相色譜儀的檢測(cè)器主要用于分析樣品信號(hào)的采集，常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、光電二極管陣列檢測(cè)器等。（1）紫外檢測(cè)器

它是利用被分析樣品對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度