雞痘細(xì)胞苗的培養(yǎng)研究

雞痘細(xì)胞苗的培養(yǎng)研究

中國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也實(shí)現(xiàn)了集約、規(guī)模化的發(fā)展，但廣闊的農(nóng)村地區(qū)仍然有一些分散的養(yǎng)殖，數(shù)量從幾十頭到幾十頭不等。廣大農(nóng)戶認(rèn)為量小不值得免疫接種,往往會(huì)導(dǎo)致雞痘的發(fā)生,而現(xiàn)階段對(duì)于雞痘還沒有有效的治療方法,因此搞好防疫是關(guān)鍵。禽痘病毒(雞、火雞、鴿、金絲雀、燈心草雀、鵪鶉、麻雀)為痘病毒科禽痘病毒屬的成員,雞痘病毒是禽痘病毒屬的代表種。雞痘的特征是在口角、雞冠、翅下等少毛或無毛處皮膚出現(xiàn)痘疹,一般稱皮膚型雞痘。另有一種主要是在口腔和咽喉部粘膜發(fā)生壞死性炎癥,形成偽膜,所以又叫“白喉”型雞痘。病雞群的病死率較低,但發(fā)病率高,可使病雞生長(zhǎng)緩慢,影響產(chǎn)蛋率,并可誘發(fā)其他傳染病。如雞群有混合感染時(shí),可造成大批死亡。雞舍擁擠、通風(fēng)不良、氨氣過多、陰暗、潮濕時(shí)都可促進(jìn)此病的發(fā)生。雞傳染性法氏囊病細(xì)胞苗的常規(guī)生產(chǎn)方法是雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)在24h內(nèi)形成致密單層后,按維持液量接入一定比例的種毒,37℃培養(yǎng)72h后收獲。收獲后的維持液經(jīng)反復(fù)凍融使細(xì)胞內(nèi)病毒充分釋放,再接毒測(cè)定其效價(jià)。由于是24h形成單層細(xì)胞后接種病毒,因而細(xì)胞脫壁現(xiàn)象發(fā)生嚴(yán)重。本試驗(yàn)在雞傳染性法氏囊病細(xì)胞苗生產(chǎn)過程中,制備CEF的同時(shí)接入種毒(稱同步接毒法),與細(xì)胞形成致密單層后再接入種毒(稱異步接毒法)兩種方法相比較,同步接毒法的病毒含量略高,且可使生產(chǎn)周期縮短近1d,并可節(jié)約種毒使用量,簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。1材料和方法1.1f雞9～10日齡的SPF雞胚(由山西隆克爾生物制藥公司提供)。1.2病毒雞痘鵪鶉化弱毒(F282E4)凍干毒,經(jīng)SPF雞胚傳代,收獲絨毛囊膜制成濕毒。1.3調(diào)ph的確定1.3.17.5%NaHCO3溶液NaHCO37.5g雙蒸水(高壓)100mL用0.2μm濾膜過濾除菌,然后分裝于小瓶中,2～8℃低溫保藏待用。1.3.2漢克氏液(Hanks液)每50mL10倍濃縮液中其他成分含量見表1分別溶于雙蒸水中過濾,然后混合在一起補(bǔ)足雙蒸水至50mL,加2mL氯仿,2～8℃低溫保存,使用時(shí),用雙蒸水稀釋10倍,經(jīng)116℃滅菌15min,使用前,以7.5%NaHCO3調(diào)pH為7.2～7.4。1.3.30.4%胰蛋白酶溶液(細(xì)胞分散液)胰酶/Hanks液的比例為:4g胰酶/100mL放入冰箱2～8℃低溫保藏過夜,待胰酶充分溶解后,用0.2μm的微孔濾膜過濾除菌,分裝于無菌小瓶中,-20℃保存待用。1.3.40.5%乳漢液(營(yíng)養(yǎng)液、自制)1.3.5雙抗的制備青霉素160萬單位/mL鏈霉素80萬單位/mL雙蒸水100mL注:用時(shí)要求乳漢液中的雙抗為100～150單位/mL1.3.6調(diào)節(jié)pH值NaHCO3一般使用經(jīng)驗(yàn)值見表2。1.4方法1.4.1胰酶的消化法選擇9～11日齡發(fā)育良好的SPF雞胚,先用碘酒棉再用酒精棉消毒雞胚氣室部位,無菌取出雞胚。將全部雞胚組織放入滅菌的玻璃平皿內(nèi),用漢氏液洗滌雞胚。用滅菌剪刀剪成米粒大小的組織塊,再用漢氏液洗2～3次,然后加0.4%的胰酶(每個(gè)雞胚大約加4mL,洗組織塊時(shí),先加少量胰酶,然后劇烈振蕩,凈置后取上清液,再往組織中加胰酶,重復(fù)上述步驟以使組織充分消化)。在37.5～38.5℃(最好能用溫度計(jì))的水浴鍋內(nèi)消化20～30min,待消化完全后遺棄上清液。用營(yíng)養(yǎng)液洗2～3次,用8層的高壓滅菌紗布過濾到高壓滅菌過的三角瓶中再加入適量營(yíng)養(yǎng)液(一般最后達(dá)到2g雞胚細(xì)胞/100mL營(yíng)養(yǎng)液或者100～150活細(xì)胞/mL細(xì)胞懸液,在乳漢液內(nèi)加犢牛血清和雙抗,犢牛血清:10mL/100mL,雙抗:鏈霉素、青霉素100～150單位/mL)。分裝到可視瓶(裝入的細(xì)胞懸液應(yīng)為可視瓶容積的10%)。1.4.2細(xì)胞單層后接毒將細(xì)胞懸浮液分成兩組,一組同步接毒,即分裝到可視瓶中立即接毒,另一組培養(yǎng)24h形成細(xì)胞單層后接毒,同條件培養(yǎng)至收獲(稀釋雞痘苗到適當(dāng)比例,接種于培養(yǎng)瓶,稀釋苗占細(xì)胞懸液體積的10%)。1.4.3收獲當(dāng)75%以上的細(xì)胞形成特異性病變時(shí)收獲(本次培養(yǎng)均在接毒后72h收獲),收集維持液并分別留樣。1.4.4釋放病毒可視瓶?jī)?nèi)留少量維持液,將收獲的液體置于-20℃冷凍,次日室溫溶解,這樣反復(fù)凍融三次使病毒充分釋放,然后取等量的兩組細(xì)胞毒懸浮液。1.4.5a氣室的安裝在11日齡雞胚的天然氣室上方打一小孔A(不要扎破氣室膜),然后在氣室下方附近避開大血管的地方扎一小孔B(不要扎破氣室膜),經(jīng)A抽吸使B成為人工氣室,最后用石蠟將A密封,B氣室朝上水平放置(B接毒位點(diǎn)待接毒后亦用石蠟密封)。1.4.6雞胚感染情況測(cè)定將維持液,稀釋成10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋度,然后接種這批11日齡SPF雞胚,孵化至120h時(shí)判斷感染情況。細(xì)胞釋放病毒后,用兩層紗布過濾,取上清液作為測(cè)毒材料,均按半成品效檢法測(cè)毒,細(xì)胞毒接種10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度,孵化至120h判斷感染情況。2結(jié)果2.1人工氣室毒的形成在接毒120h后,發(fā)現(xiàn)雞尿囊腫大,在接毒處有痘斑異物出現(xiàn)(圖1)。2.2中毒前后雞的胚胎細(xì)胞(1)考慮到重疊顯微鏡10倍，觀察到同時(shí)感染的雞骨細(xì)胞。結(jié)果如圖2和圖2所示(2)雞胚細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞數(shù)對(duì)比的影響通過倒置顯微鏡觀察,同步感染前的雞胚細(xì)胞數(shù)目比較稀少、分散,細(xì)胞呈圓形或橢圓形;同步感染后的雞胚細(xì)胞數(shù)目顯著增多、密集,細(xì)胞呈橢圓形居多。接毒前的CEF在可視瓶?jī)?nèi)呈梭形或不規(guī)則三角形生長(zhǎng),細(xì)胞中央有卵圓形核,接毒后,細(xì)胞輪廓會(huì)增強(qiáng),反差增大,胞質(zhì)中時(shí)而出現(xiàn)一些顆粒。2.3液體試驗(yàn)的結(jié)果維持液測(cè)毒結(jié)果見表3、表4。2.4骨病毒含量檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞內(nèi)病毒含量檢測(cè)結(jié)果見表5、表6。3雞蚤對(duì)同步法接毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)維持液內(nèi)含有一定量的成熟病毒,兩種接毒法10-4稀釋組雞胚幾乎全感染,異步接毒感染胚數(shù)較同步接毒多,但都達(dá)不到《規(guī)程》配苗要求(表3、表4)。(2)細(xì)胞內(nèi)含毒量均達(dá)到10-5全感染,同步接毒10-6稀釋也全感染,說明同步接毒細(xì)胞毒含量高(表5、表6)。(3)雞痘病毒雖屬細(xì)胞結(jié)合毒,但弱毒細(xì)胞培養(yǎng)物會(huì)隨細(xì)胞衰老死亡、崩解、脫落于維持液內(nèi),使維持液內(nèi)含有一定量的成熟病毒。異步法接毒維持液病毒含量高也證明了這一點(diǎn)。因?yàn)楫惒椒ㄅ囵B(yǎng)時(shí)間較同步法長(zhǎng),所以細(xì)胞老化、脫落增加,使維持液病毒含量增高(表3、表4)。(4)同步接毒細(xì)胞病毒含量高可能有兩個(gè)原因,一是因?yàn)榧?xì)胞在分裂增殖的同時(shí)病毒感染,病毒不必再通過細(xì)胞間傳遞而幾乎侵染了全體細(xì)胞,病毒細(xì)胞數(shù)量多(圖3),另外整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間為72h,較異步法縮短24h,細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)環(huán)境好、脫落少(表5、表6)。(5)雞痘細(xì)胞生產(chǎn)中一直以收獲病變細(xì)胞為制苗材料,所以同步法接毒較異步法優(yōu)越,但維持液內(nèi)含量也相當(dāng)可觀,是否考慮綜合利用,另外雞痘的測(cè)毒方法是否可以改進(jìn),以期更精確定量病毒。(6)本試驗(yàn)中采取的是全雞胚作為實(shí)驗(yàn)材料也是一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)。雞胚的眼、喙、內(nèi)臟等組織雖然被剪成碎塊卻不易被胰蛋白酶消化分散,更不具備成纖維細(xì)胞貼壁的特性和優(yōu)勢(shì)。效價(jià)測(cè)定結(jié)果表明,即便是有極少數(shù)的肝樣細(xì)胞貼壁也未影響其病毒產(chǎn)量。(7)采用全胚法制備雞胚成纖維單層細(xì)胞與常規(guī)法制備相比,其雞胚利用率提高2倍以上。此法在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用可顯著降低成本,簡(jiǎn)化工藝,縮短解剖時(shí)間,而且減少了手術(shù)污染的機(jī)率。(8)本試驗(yàn)選取的是在人工氣室上接毒,這種接毒方式會(huì)比