正電-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定白菜中丁硫克百威及其代謝物

正電-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定白菜中丁硫克百威及其代謝物

丁硫醇是由美國(guó)氨基公司開(kāi)發(fā)的氨基丙烯酸農(nóng)藥。這是一種高度抽象和安全的藥物。它對(duì)控制水果、蔬菜、玉米、棉花、水稻、甘蔗等作物和昆蟲(chóng)都發(fā)揮著重要作用，在中國(guó)廣為應(yīng)用。丁硫克百威在環(huán)境中可通過(guò)羥基化和氧化反應(yīng)代謝為克百威(carbofuran),繼而轉(zhuǎn)變?yōu)榇x物3-羥基克百威(3-hydroxycarbofuran)和3-酮基克百威(3-ketocarbofuran),而3種代謝物的毒性遠(yuǎn)高于丁硫克百威。因此研究丁硫克百威在蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品中的殘留時(shí),應(yīng)將其與代謝物同時(shí)研究才有意義。農(nóng)藥殘留聯(lián)席會(huì)議(JMPR)已將丁硫克百威的殘留定義為丁硫克百威及其代謝物克百威、3-羥基克百威的殘留總和;日本肯定列表(TheJapanesePositiveListSystem)同時(shí)規(guī)定在未檢測(cè)到丁硫克百威母體時(shí)則使用克百威(包括3-羥基克百威,以克百威表示)的殘留限量判定;而中國(guó)最新發(fā)布的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB2763—2012)則與歐盟一樣,規(guī)定丁硫克百威的殘留物為其自身,不包含代謝物,但同時(shí)也制定了克百威的殘留限量。已有研究表明,丁硫克百威在柑橘、稻米等作物中除了會(huì)代謝為克百威和3-羥基克百威外,也會(huì)進(jìn)一步代謝成具有較高毒性的3-酮基克百威,因此若只檢測(cè)克百威和3-羥基克百威對(duì)部分農(nóng)產(chǎn)品而言則可能低估其殘留風(fēng)險(xiǎn)。目前常用于丁硫克百威及其代謝物提取的方法主要是液液萃取法(LLE),但此法存在費(fèi)時(shí)、溶劑用量大及易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象等缺點(diǎn)。相關(guān)的儀器分析方法已有較多報(bào)道:如采用氣相色譜法檢測(cè)韭菜與土壤、氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)辣椒中的丁硫克百威及其代謝物殘留,采用液相色譜法測(cè)定丁硫克百威、液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)柑橘中的丁硫克百威及其7種代謝物殘留等。徐應(yīng)明、黃士忠等在研究丁硫克百威在韭菜與蘋(píng)果中的殘留動(dòng)態(tài)時(shí),單獨(dú)提取了3-羥基克百威,然后通過(guò)衍生化將其轉(zhuǎn)化成3-乙氧基克百威后再進(jìn)行檢測(cè),操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)。為了實(shí)現(xiàn)丁硫克百威及其代謝物的同步檢測(cè),筆者采用提取能力強(qiáng)、萃取時(shí)間短、回收率高的加速溶劑萃取法(Acceleratedsolventextraction,ASE)提取,固相萃取(SPE)凈化,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè),內(nèi)標(biāo)法定量,研究建立了白菜中丁硫克百威及其3種代謝物克百威、3-羥基克百威和3-酮基克百威的同步檢測(cè)方法。1材料和方法1.1儀器、試藥和儀器Agilent1200series液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);API2000質(zhì)譜儀(ABSciex公司);LuxCellulose-1(150mm×2.00mm,粒徑3μm)色譜柱(美國(guó)Phenomenex公司);ASE-300型加速溶劑萃取儀(美國(guó)Dionex公司),配有34mL萃取池;NE-1101V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化株氏會(huì)社);PL602-L型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);GrindomixGM200型研磨機(jī)(德國(guó)Retsch公司)。丁硫克百威(Carbosulfan,96%)、克百威(Carbofuran,98%)、3-羥基克百威(98.5%)、3-酮基克百威(96%)、氘代克百威(99%)標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司);二氯甲烷、甲醇、乙腈等試劑為色譜純;Hydromatrix硅藻土及Carbon/NH2固相萃取小柱(500mg/6mL)(美國(guó)Agilent公司);0.22μm有機(jī)微孔濾膜。200g/L丁硫克百威乳油,購(gòu)自天津市綠亨化工有限公司。新鮮白菜樣品購(gòu)自超市,使用前切成小塊,用研磨機(jī)粉碎均勻,凍存于-20℃冰箱中。取適量丁硫克百威、克百威、3-羥基克百威、3-酮基克百威和內(nèi)標(biāo)氘代克百威標(biāo)準(zhǔn)品,分別用甲醇配制成約1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)母液。各取適量母液及內(nèi)標(biāo)溶液,用甲醇和空白基質(zhì)溶液分別配制成丁硫克百威及其代謝物質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0mg/L,內(nèi)標(biāo)為0.5mg/L的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,置于4℃冰箱中保存,現(xiàn)配現(xiàn)用。1.2萃取萃取液的制備準(zhǔn)確稱取10g粉碎后的白菜樣品于陶瓷坩堝中,加入5g硅藻土,用研棒研磨混合,裝入34mL的ASE萃取池中。以二氯甲烷為萃取溶劑,在壓力10342.5kPa、溫度100℃下,預(yù)加熱平衡5min,靜態(tài)萃取5min,用60%萃取池體積的二氯甲烷快速?zèng)_洗樣品,氮?dú)獯祾?0s,2次循環(huán),收集全部萃取液。加入約15g無(wú)水硫酸鈉干燥,上清液轉(zhuǎn)入100mL雞心瓶中,用10mL乙酸乙酯洗滌后合并于雞心瓶中,加入100μL含有1%甘油的乙酸乙酯作保護(hù)劑,35℃水浴減壓旋蒸至2mL左右,待凈化。1.3耐氧合物洗脫先用10mLV(乙腈)∶V(二氯甲烷)=3∶1的混合溶劑活化Carbon/NH2小柱,然后將雞心瓶中溶液轉(zhuǎn)入小柱,用上述混合溶劑涮洗雞心瓶后一并過(guò)柱,最后用40mL上述溶液洗脫。收集所有流出液,于40℃水浴下減壓旋蒸至干,用2mL甲醇定容,過(guò)0.22μm濾膜,待LC測(cè)定。1.4分析和測(cè)量1.4.1含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸流動(dòng)相A為5mmol/L的乙酸銨水溶液(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸);B為乙腈;C為甲醇。采用梯度洗脫(見(jiàn)表1)。流速300μL/min;進(jìn)樣體積10μL。1.4.2離子源溫度及干燥氣gas離子源掃描方式為(ESI+);氣簾氣CUR:103kPa;碰撞氣CAD:21kPa;離子源溫度TEM為450℃;電離電壓IS:5500V;霧化氣Gas1:241kPa;干燥氣Gas2:207kPa;質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);丁硫克百威及其代謝物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。1.5空白對(duì)照區(qū)保護(hù)于2011年在北京市海淀區(qū)選取露地種植的白菜Brassicarapapekinensis,每處理小區(qū)面積20m2,重復(fù)3次,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照區(qū),小區(qū)間設(shè)保護(hù)行。當(dāng)白菜長(zhǎng)到成熟個(gè)體一半大小時(shí),用200g/L的丁硫克百威乳油以有效成分180g/hm2的劑量噴霧施藥1次,分別于施藥后2h和1、3、5、7、10、14、21、30、40d隨機(jī)在各小區(qū)內(nèi)采集白菜1~2kg,切碎,經(jīng)四分法縮分后保留約200g,于-20℃冰柜中儲(chǔ)存,待測(cè)。2結(jié)果與討論2.1萃取條件優(yōu)化對(duì)ASE的萃取溶劑[二氯甲烷、V(二氯甲烷)∶V(丙酮)=1∶1和V(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1]、溫度(60,80和100℃)、萃取時(shí)間(5,10min)及萃取循環(huán)次數(shù)(1,2)等條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:以二氯甲烷作萃取溶劑時(shí),丁硫克百威及其代謝物的回收率最好;溫度對(duì)克百威萃取的影響不大,但當(dāng)萃取溫度為100℃時(shí),丁硫克百威及3-酮基克百威的回收率較高;采用2次循環(huán)萃取的結(jié)果明顯好于1次的,此時(shí)萃取5min即可達(dá)到要求,與萃取10min的相差不大。因此,ASE萃取的最終條件確定為:以二氯甲烷為萃取劑,萃取溫度100℃,時(shí)間5min,循環(huán)萃取2次。2.2洗脫液體積的優(yōu)化白菜樣品經(jīng)過(guò)ASE萃取后,溶液顏色較深,雜質(zhì)較多,采用QuEChERS方法常用的PSA和C18等材料凈化效果不佳,不能將大量色素去除。Carbon/NH2小柱可有效去除葉綠素等色素干擾物質(zhì),且石墨化炭黑對(duì)分子中含有平面芳香環(huán)的化合物吸附作用最強(qiáng),可以起到較好的凈化效果。通過(guò)比較V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=3∶1、V(乙腈)∶V(乙酸乙酯)=1∶1和V(乙腈)∶V(乙酸乙酯)=1∶3共3種混合溶劑對(duì)目標(biāo)物的洗脫能力,發(fā)現(xiàn)用V(乙腈):V(二氯甲烷)=3∶1洗脫時(shí),丁硫克百威及其3種代謝物的回收率均符合要求。不同洗脫液體積(20,30,40mL)的對(duì)比結(jié)果顯示,克百威與3-羥基克百威較易被洗脫,隨著洗脫體積的增加,丁硫克百威與3-酮基克百威的回收率也隨之增加,當(dāng)洗脫體積為40mL時(shí),丁硫克百威的回收率可達(dá)90%以上。因此本研究選定洗脫液為V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=3∶1,體積為40mL。2.3不同階段添加丁硫克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液的法由于丁硫克百威存在不穩(wěn)定的問(wèn)題,因此本研究對(duì)丁硫克百威標(biāo)準(zhǔn)品及其在前處理過(guò)程中的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。在樣品前處理過(guò)程中,采取不同階段添加丁硫克百威單一標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法,將處理后的樣品進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定,發(fā)現(xiàn)不同階段添加丁硫克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品回收率均在90%左右,且其與克百威的比例無(wú)明顯變化,說(shuō)明克百威含量并未增加,而且也未檢出3-羥基克百威和3-酮基克百威,說(shuō)明丁硫克百威在本研究的樣品前處理過(guò)程中未發(fā)生明顯降解,檢測(cè)出的代謝物是樣品自有的產(chǎn)物,而并非前處理過(guò)程中產(chǎn)生的。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制基質(zhì)常常會(huì)對(duì)分析過(guò)程產(chǎn)生顯著的干擾,影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。影響基質(zhì)效應(yīng)的因素有很多,包括待測(cè)農(nóng)藥本身的性質(zhì)、樣品基質(zhì)的性質(zhì)、農(nóng)藥和樣品基質(zhì)之間的比例等。采用溶劑和基質(zhì)空白溶液分別配制一系列丁硫克百威及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,加入氘代克百威為內(nèi)標(biāo)物后進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定,以峰面積比為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)最小二乘法擬合得到2條曲線,比較兩者的斜率以確定基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱(見(jiàn)表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),丁硫克百威、克百威和3-羥基克百威均存在不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。為了消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量計(jì)算。2.5測(cè)定條件分析在空白白菜樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,對(duì)4種目標(biāo)物進(jìn)行了3個(gè)水平的添加回收試驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)5次,采用內(nèi)標(biāo)法定量,結(jié)果見(jiàn)表4。相關(guān)譜圖分別見(jiàn)圖1和圖2。如圖1中所示,克百威與3-酮基克百威均在7min左右出峰,其色譜峰是重疊的,但由于本研究使用LC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè),可以利用物質(zhì)間不同離子對(duì)對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量。白菜中丁硫克百威及其代謝物的檢出限(LOD)為0.002~0.01mg/kg,定量限(LOQ)為0.005~0.02mg/kg,添加回收率為85%~122%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%~12.5%,說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。2.6丁硫克百威在西瓜1e-0.774t的降解消解動(dòng)態(tài)結(jié)果(圖3)顯示,丁硫克百威在白菜上噴施后會(huì)代謝為克百威、3-羥基克百威和3-酮基克百威。以200g/L丁硫克百威乳油按有效成分180g/hm2在露地白菜上噴霧1次,白菜中丁硫克百威的原始沉積量為2.37mg/kg,消解動(dòng)態(tài)回歸方程為ct=1.5711e-0.774t(R2=0.9067),消解半衰期為0.9d。丁硫克百威在白菜中的降解速率很快,在1d時(shí)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低至0.17mg/kg,消解率達(dá)到90%以上,3d即達(dá)到95%以上;克百威在施藥后當(dāng)天即達(dá)到最大值1.76mg/kg,1d內(nèi)降解至0.47mg/kg,消解率達(dá)到70%以上,在7d時(shí)達(dá)到95%以上,比丁硫克百威降解稍慢;3-羥基克百威和3-酮基克百威的殘留量則呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),在1d時(shí)分別達(dá)到最大值,之后不斷降解,至3d時(shí)達(dá)80%,7d時(shí)達(dá)約95%。施藥當(dāng)天,克百威在3個(gè)代謝物中的比例最高,達(dá)79%,其次為3-羥基克百威(19%),最低為3-酮基克百威(2%),隨著時(shí)間的推移,克百威會(huì)進(jìn)一步降解為3-羥基克百威和3-酮基克百威,