降解菌hq-c-01對克百威污染土壤的修復(fù)作用

降解菌hq-c-01對克百威污染土壤的修復(fù)作用

克氏合金是一種高效、光譜內(nèi)毒的殺螨劑。作為氨基甲酸酯農(nóng)藥的代表，它被廣泛用于水稻、棉花、小麥、玉米、大豆和甘蔗等作物。然而隨著此類殺蟲劑使用范圍的不斷擴(kuò)大,農(nóng)藥殘留對土壤及地下水造成了不同程度的污染。通過自然界的富集和生物鏈進(jìn)入生物體內(nèi),嚴(yán)重危害人類的健康和生存環(huán)境。國際上規(guī)定單種氨基甲酸酯殺蟲劑在谷物中的最高殘留量(MRL)為0.02~7.00mg/kg,飲用水中的MRL是0.1μg/L。并且克百威殘留易被淋溶而直接進(jìn)入環(huán)境,致使環(huán)境污染嚴(yán)重。因此有效地控制克百威殘留,對緩解農(nóng)產(chǎn)品、土壤及環(huán)境水的污染有重要意義。而生物修復(fù)是一種低成本的環(huán)境友好型去除污染物的方法。近年來國內(nèi)外對克百威微生物降解的研究報道較多。國內(nèi)在本領(lǐng)域的研究主要集中在環(huán)境中農(nóng)藥殘留生物降解菌的篩選、降解特性研究等基礎(chǔ)層面,而應(yīng)用方面的研究鮮有報道。本研究以實(shí)驗(yàn)室分離的高效克百威降解菌HQ-C-01為對象,在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下研究各種環(huán)境因子對其修復(fù)克百威污染土壤的影響,同時研究克百威及降解菌的使用對土壤微生物的影響,旨在為其在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1有機(jī)質(zhì)含量及含水量采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場未施用過克百威農(nóng)藥土壤的表層(0~15cm),土壤pH值5.7,有機(jī)質(zhì)含量36.934g/kg,總N0.649g/kg,總P0.936g/kg,總K19.841g/kg,含水量383.1g/kg。土壤過5mm篩,保濕儲存(每皿裝土0.1kg,用薄膜封口,留有少許氣孔,以維持水分和通氣量,放在避光處),以供后續(xù)使用。1.1.2克百威的誘導(dǎo)誘導(dǎo)培養(yǎng)菌株HQ-C-01屬異常畢赤酵母(Pichiaanomala)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)胡美英教授課題組篩選保存。在48h內(nèi)對50mg/L克百威降解率達(dá)到95.2%。將分離得到的菌株HQ-C-01劃線轉(zhuǎn)接到添加克百威殺蟲劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中馴化,克百威添加濃度為100、200、300、400、500mg/L。將菌株接種到NADY培養(yǎng)基中,26.8℃,200r/min震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后期。將培養(yǎng)液4℃,8000r/s離心,收取菌體并用磷酸鹽緩沖液洗滌2次。再用磷酸鹽緩沖液重懸控制菌體濃度至所需濃度備用。1.2測試方法1.2.1高效液相色譜法測定準(zhǔn)確稱取2g土樣于50ml玻璃離心管中,加入30ml二氯甲烷,經(jīng)振蕩器震蕩5min,然后經(jīng)超聲波超聲震蕩2h,6000r/s離心,收集上層液至50ml圓底燒瓶,并用二氯甲烷分3次洗劑下層土壤和離心管。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至瓶底1~2ml液體,用分析甲醇分3次洗劑圓底燒瓶,將洗液轉(zhuǎn)移至5ml刻度試管,最后定容至5ml。用10ml注射器吸取洗液過孔徑0.45μm的有機(jī)濾頭,將濾液收集至進(jìn)樣瓶,以備測定。高效液相色譜(HPLC)測定條件如下:型號為HP-1100,色譜柱為C18反相柱(ODSHypersil5μm,125mm×4mm),柱溫為常溫,流動相為甲醇/水=55/45(v/v),檢測波長為275nm,流速為1ml/min,進(jìn)樣量10μl。依此條件,添加回收率測定結(jié)果表明,當(dāng)克百威添加質(zhì)量濃度分別為5~400mg/L時,回收率都能達(dá)到90%以上,提取和分析方法可信。1.2.2土壤菌濃度測定將克百威原藥按104mg/L的濃度配成甲醇溶液,以50mg/kg施用于供試土壤攪拌均勻。待溶劑揮發(fā)土樣自然風(fēng)干后加入不同濃度的菌液,使土壤菌濃度為0.47×107、1.82×107、5.76×107、10.2×107、20.9×107、39.1×107CFU/g干土,以不接菌處理為對照,每個處理3個重復(fù)。保持土壤濕度600g/kg于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),10天后取樣,采用高效液相色譜法測定克百威含量。1.2.3土壤細(xì)菌和對農(nóng)藥的控制在準(zhǔn)備好的土樣中分別加入不同濃度克百威,使其終濃度為10、50、100、200mg/kg,混勻,待溶劑揮發(fā)土樣自然風(fēng)干后,每個處理接108CFU/g的菌液,每個處理分別以添加相同濃度的農(nóng)藥且不接菌處理為對照,每個處理3個重復(fù),控制土壤含水量為600g/kg,于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天稱重給土壤補(bǔ)足水分。1、3、5、7、10天取樣采用高效液相色譜法測定土壤中克百威含量。1.2.4不同菌種的土樣制備用甲醇配置濃度為400mg/L的克百威,稱取烘干的滅菌土(135℃下干熱滅菌3h)0.1kg,加入克百威使土壤中克百威濃度為50mg/kg,混勻,自然風(fēng)干,待溶劑揮發(fā)后待用。加入干燥的菌粉,使土壤中降解菌含量為108CFU/g干土,分別加入不同量的滅菌水,充分?jǐn)嚢枞芙?將其加入土樣中,以其含水量為100、200、300、400、600g/kg。以含水量低于50g/kg干燥土壤處理為對照,每個處理3次重復(fù),于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天稱重給土壤補(bǔ)足水分,10天后采用高效液相色譜法測定土壤中克百威含量,并計算菌株對土壤中克百威的降解率。1.2.5不同菌株對土壤中克百威的降解稱取添加含量為50mg/kg克百威滅菌土壤0.1kg,加入濃度為108CFU/g的菌劑,用滅菌水調(diào)整土壤含水量600g/kg,分別保存在20、25、30、35、40℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以不加菌30℃培養(yǎng)處理為對照,每個處理3個重復(fù),每天稱重補(bǔ)足水分,培養(yǎng)10天后采用高效液相色譜法測定克百威含量,并計算菌株對土壤中克百威的降解率。1.2.60、9.0、10.0、10.稱取添加含量為50mg/kg克百威滅菌土壤0.1kg,調(diào)整土壤pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。加入108CFU/g菌液,以pH7.0不接菌處理為對照,用滅菌水調(diào)整土壤含水量為600g/kg每個處理3個重復(fù),每天稱重補(bǔ)足水分,于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天,經(jīng)高效液相色譜測定土壤中克百威含量,并計算菌株對土壤中克百威的降解率。1.2.7不同土樣的菌落培養(yǎng)稱取采自農(nóng)場未經(jīng)處理的土樣0.1kg,放入培養(yǎng)皿中,保持濕度。試驗(yàn)設(shè)5個處理,處理1在土樣中加入克百威使其含量為50mg/kg;處理2為在土樣中施用菌液,使菌液濃度為108CFU/g;處理3為在克百威含量為50mg/kg的土樣中加入108CFU/g菌液;處理4為施用不接菌的培養(yǎng)基。處理5為使用相同量的滅菌水。每個處理3個重復(fù)。每天稱重補(bǔ)足水分以保持濕度。處理后5天采用平板菌落計數(shù)法計數(shù)。同時設(shè)定另一個處理:在0.1kg干熱滅菌土中添加克百威使其濃度為50mg/kg。5天后采用高效液相色譜法測定處理1和處理3以及滅菌土樣中克百威含量,并計算克百威的降解率。2結(jié)果與分析2.1克百威降解率試驗(yàn)結(jié)果(圖1)顯示:不同接種量的降解菌對土壤中克百威都有一定的降解作用,降解菌接種量為5.76×107~20.9×107CFU/g干土?xí)r,克百威降解率為69.75%~82.42%。當(dāng)降解菌接種量為39.1×107時,克百威降解率最大,為86.74%。隨著降解菌接種量的增大克百威降解率也升高。當(dāng)降解菌接種量較大時,隨著接種量的增大,克百威降解率增加較緩慢。原因可能是當(dāng)降解菌接種量達(dá)到一定量時,降解菌與底物克百威充分接觸,此時降解菌接種量已經(jīng)不是克百威降解率的制約因素,而土壤濕度、pH、溫度等其他因子成為影響克百威降解率的主要因素。2.2g克百威的降解試驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示:將土樣接種相同量的菌液,該菌株對10~200mg/kg濃度的克百威均有較好的降解效果。降解菌對10mg/kg克百威10天降解率為80.23%。降解菌對50mg/kg克百威10天降解率最高,達(dá)到87.42%。對濃度為100mg/kg和200mg/kg克百威10天降解率分別為78.35%和75.36%?？梢钥闯鼋到饩鶫Q-C-01不但能降解低濃度的克百威,對高濃度克百威也有較好的降解效果。在1~5天期間各處理降解菌對克百威的降解率影響差異較大,隨著時間增長,至7~10天時處理之間降解率差異逐漸縮小。2.3克百威降解效果試驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示,土壤含水量在100~600g/kg的范圍內(nèi),隨著含水量的增加降解菌對土樣中克百威的降解率增大。在土壤含水量為400~600g/kg范圍內(nèi)克百威降解效果較好,土壤中克百威殘留濃度僅為13.43~7.34mg/kg,降解菌對克百威降解率為73.15%~85.32%。當(dāng)土壤含水量低至100g/kg時,克百威降解率明顯下降,僅為26.74%,含水量低降解菌生長繁殖速度降低,導(dǎo)致對克百威農(nóng)藥殘留速率減慢?？梢钥闯鐾寥篮繉到庑Ч绊戄^大。代先祝等利用阿特拉津降解菌Arthrobactersp.進(jìn)行土壤試驗(yàn)時也發(fā)現(xiàn)土壤含水量<100g/kg時降解效率開始明顯降低。2.4溫度對克百威的影響試驗(yàn)結(jié)果(圖4)顯示,土樣溫度為30℃時,土壤中克百威的殘留濃度僅為7.17mg/kg,降解率達(dá)85.67%。在20℃和40℃時克百威在土壤中的殘留濃度為18.14mg/kg和24.37mg/kg,降解率分別為63.72%和51.26%,表明較低和較高溫度對土壤中克百威的降解有一定促進(jìn)作用。在20℃~30℃時降解率不斷增大,30℃~40℃范圍內(nèi)降解率下降。說明該降解菌對土壤溫度適應(yīng)范圍較大,在土壤溫度為30℃左右降解菌對土壤中克百威殘留降解效果最好。2.5ph對克百威的影響試驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示,在pH為7時土壤中克百威殘留濃度為7.20mg/kg,降解率達(dá)85.62%。在pH范圍6~8時降解菌對土壤中克百威降解率為68.24%~75.07%。在pH4~7范圍內(nèi)降解菌對克百威的降解率逐漸升高,在pH7~10范圍內(nèi)降解率隨pH的升高而降低。在相對較酸性和較堿性條件下,降解率較低?？税偻趬A性條件下不穩(wěn)定,自身的分解較嚴(yán)重,而此時降解菌的活動較弱,降解率較低。降解菌對土壤中克百威降解率因pH不同變化較大,表明pH對降解率有顯著的影響。分析其原因是因?yàn)樵趐H較高和較低的條件下降解菌生長受到抑制,降解菌的生命活動較弱,降解菌降解特性發(fā)揮受到抑制。Yan等分離得到的Novosphingobiumsp.FND-3在pH為6時對克百威降解效果最好。2.6克百威對土壤真菌、細(xì)菌的影響不同試驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示:經(jīng)Duncan新復(fù)極差法分析,對照處理中生物菌落計數(shù)真菌和細(xì)菌都低于其他處理,特別是真菌數(shù)量,與其他處理差異達(dá)顯著水平。而處理1和處理2真菌數(shù)量均明顯高于對照處理。說明克百威及降解菌的使用對土壤微生物群落均有一定影響。處理1土壤真菌數(shù)為2.86×104CFU/g明顯多于其他處理,是對照處理真菌數(shù)的兩倍多,說明克百威對土壤真菌影響較大,有較強(qiáng)的刺激作用,使真菌數(shù)迅速增加;而處理3真菌數(shù)為1.59×104CFU/g,表明降解菌分解克百威,對污染土壤修復(fù),消除克百威對土壤真菌的刺激,使土壤中微生物數(shù)量逐漸恢復(fù)到原來水平。處理2真菌數(shù)量和細(xì)菌數(shù)量與處理4差異不明顯,說明降解菌對土壤中土著微生物影響較小。處理1和處理2的細(xì)菌數(shù)于對照處理處于同一水平,表明克百威對細(xì)菌影響相對較小。而處理3的細(xì)菌數(shù)量與對照處理差異明顯,降解菌對土壤細(xì)菌有一定的影響。胡江等發(fā)現(xiàn)阿特拉津?qū)ν寥乐姓婢图?xì)菌有較強(qiáng)的刺激作用。可見不同藥劑對土壤中微生物影響不同。經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn),5天后處理1和處理3土樣中克百威含量分別為46.8mg/kg和12.4mg/kg,而滅菌土中克百威含量為49.2mg/kg?？税偻谔幚?、3和滅菌土壤中的降解率分別為6.4%、75.2%和1.5%?？梢钥闯?與滅菌處理相比,土壤中原有土著菌株對克百威有一定的降解作用,但是降解效果不明顯。在土壤中添加降解菌可以明顯地增加克百威在土壤中的消解速度。這與Plangklang等的研究結(jié)果相一致。3對環(huán)境的適應(yīng)性降解菌株HQ-C-01在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下,能夠很好地降解土壤中的克百威,在接種量為108CFU/g時降解效果較好,土壤中克百威濃度為50mg/kg10天后經(jīng)降解菌的降解在土壤中的濃度僅為6.63mg/kg,降解率為86.74%,同時菌株HQ-C-01對濃度為200mg/kg克百威也有較好的降解率,而很多分離的降解菌對較高濃度的克百威降解效果較差。土壤含水量對降解效果影響較大,含水量400~600g/kg時可有效地降解土壤中克百威,降解率為73.15%~85.32%,土壤含水低于200g/kg時降解效果較差。Clotaire等用假單胞菌株YAY6進(jìn)行土壤試驗(yàn)時也發(fā)現(xiàn)土壤含水量<200g/kg時降解效率開始明顯降低。降解菌HQ-C-01對土壤溫度適有較好的適應(yīng)性,在溫度25℃~35℃范圍內(nèi)降解效果最好,降解率在78.24%~88.67%范圍內(nèi);土壤pH對降解率影響較大,在pH6~8范圍內(nèi)降解菌的降解效果較好,在較低和較高pH土壤中降解菌的生長受到抑制,可能是一些關(guān)鍵酶在酸和堿性條件下活性較低,從而降解率較低;克百威的使用改變土壤中微生物菌群,而降解菌HQ-C-01通過降解土壤中的微生物對受污染土壤進(jìn)行修復(fù),消除克百威對土壤微生物的刺激,恢復(fù)土壤微生物種群結(jié)構(gòu)。農(nóng)藥殘留的土壤原位生物修復(fù)是近年來發(fā)展的一項(xiàng)將生物技術(shù)用于解決生態(tài)環(huán)境農(nóng)藥污染的方法,有效解決土壤中農(nóng)藥殘留。目前氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解酵母菌報道較少,并且傳統(tǒng)的降解菌方面的研究多數(shù)停留在降解菌的分離和降解特性的研究上。本研究采用的降解菌株HQ-C-01經(jīng)初步鑒定為酵母菌,耐受環(huán)境條件范圍較廣,并且在存有許多抗生素的條件